超高效液相色谱-飞行时间-串联质谱法对3 种蓝靛果忍冬果实中花青苷的比较分析

张上上，郑姝宁，王学涛，倪 阳，王 英

（1.秦皇岛市食品药品检验中心，河北 秦皇岛 066000；2.中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业农村部蔬菜产品质量安全风险评估实验室（北京），北京 100081）

蓝靛果忍冬（Lonicera caeruleaL.），又名蓝靛果，属于忍冬科忍冬属多年生落叶小灌木，是一种新兴的野生浆果资源。蓝靛果忍冬喜冷凉湿润性气候，抗寒能力强[1]，主要分布在我国吉林省长白山、黑龙江省大兴安岭山区[2]。果实为紫黑色或蓝黑色浆果，椭圆形或长圆形，皮薄籽小，质地细腻，口感酸甜风味独特，可鲜食，出汁率高，适合加工成酒类、饮料、果酱等衍生食品[3-4]。研究发现，蓝靛果忍冬果实含有丰富的营养物质如糖类、有机酸、氨基酸、矿物质、维生素和微量元素等，还含有花青苷、黄酮、三萜、原花青素、儿茶素等活性物质[5-8]。在传统医学中，蓝靛果忍冬果实可入药, 性苦凉，具有清热泻火、散痈消肿等功效，可用于治疗湿热痢疾、大便赤白等疾病。现代医学研究表明，蓝靛果忍冬具有促进血液循环、防治心血管病、降血压、清热解毒、抗疲劳、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗辐射、改善肝脏的解毒功能等功效[9-11]。可见，蓝靛果忍冬是一种具有较高营养价值和药用价值的小浆果，具有广阔的开发利用前景。

花青苷是常见的植物水溶性色素，是一类具有苯并吡喃结构的类黄酮化合物，是植物体内重要的次级代谢产物。蓝靛果含有丰富的花青苷，不仅可以作为天然色素的良好来源，也是蓝靛果忍冬生物学活性的重要物质基础，具有抗氧化、清除自由基、降血脂、降血糖、抗炎、抗肿瘤、调节免疫、改善血液循环和预防心血管疾病等多种活性[12-16]。花青苷的化学结构决定其生物学功能，不同的花青苷苷元、糖基基团、酰基基团及其不同的结合方式，形成不同种类的花青苷进而具有不同的生物学活性。因此，研究蓝靛果忍冬花青苷的组成和相对含量，对综合开发蓝靛果忍冬相关产品具有重要意义。

已有研究表明[17]，不同品种的蓝靛果忍冬果实性状差异较大，综合平均单株产量、百果质量、最大单果质量、果实横径、果实纵径、果实风味等方面，发现蓝靛果忍冬格尔达、伊利亚特和别列里的表现较好。因此本研究以这3 种蓝靛果忍冬为研究材料，利用超高效液相色谱-飞行时间-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-time of flight-tandem mass spectrometry，UPLC-TOF-MS/MS）技术，比较研究3 种不同品种蓝靛果忍冬果实中花青苷的种类、分子结构和相对含量，以期为进一步研究花青苷在蓝靛果忍冬中合成与积累的分子遗传机制以及选育富含花青苷的蓝靛果忍冬优良品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝靛果忍冬果实购于黑龙江省黑河市中俄林业科技合作园。挑选出生长良好、无病虫害和机械损伤、成熟期的蓝靛果忍冬果实，其中伊利亚特果皮为蓝紫色，果肉为深红色，果实形状为椭圆形，最大单果质量为1.37 g；别列里果皮为蓝紫色，果肉为深红色，果实形状为长圆形，最大单果质量为1.44 g；格尔达果皮为蓝紫色，果肉为浅红色，果实形状为椭圆形，最大单果质量为1.05 g。液氮速冻后转移至－80 ℃冷冻贮藏备用。

乙腈（色谱级） 美国JT Baker公司；甲酸、盐酸（均为色谱级） 美国Fluka公司；花青苷标准物质：飞燕草色素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-阿拉伯糖苷、矢车菊素-3-木糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-半乳糖酸木糖苷、矢车菊素-3-芸香糖苷、矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-槐糖苷、芍药素-3-芸香糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷（纯度均大于97%） 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

LC-30A UPLC仪 日本岛津公司；6600 TOF-MS/MS仪 美国应用生物系统公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

花青苷的提取参考文献[18]的方法并加以改进。将冷冻的蓝靛果忍冬果实常温解冻后匀浆，准确称取2.00 g匀浆液于50 mL离心管中，加入10 mL酸化甲醇提取液（0.1% HCl，V/V），振荡混匀后室温下超声提取30 min。其中酸化甲醇提取液能够防止花青苷的降解[19]。4 ℃、13 000 r/min离心15 min，上清液于35 ℃旋转蒸干。取2.0 mL酸化超纯水（0.1%甲酸，V/V）进行复溶，经0.22 μm滤膜过滤，滤液进样分析。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：溶剂A为水溶液（0.1%甲酸，V/V）；溶剂B为乙腈溶液（0.1%甲酸，V/V）；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量2 μL。梯度洗脱条件见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program for liquid chromatography

1.3.3 质谱条件

AB SCIEX 6600 TOF-MS/MS系统，配Turbo VTM源离子；正离子扫描方式，喷雾电压＋5 500 V；飞行时间质谱全扫描-信息关联采集-子离子扫描（TOF-MS scan-IDA-product ion scan）模式；全扫描m/z100～1 000，分辨率30 000 FWHM；雾化气压力0.34 MPa，气帘气压力0.24 MPa，辅助雾化气压力0.34 MPa，以上3 种气体均为氮气；离子源温度为550 ℃；去簇电压80 V；IDA触发10 个子离子扫描，即每个循环选择10 个最强的离子进行MS/MS分析；子离子扫描的m/z50～1 000，碰撞电压35 eV，碰撞电压差15 eV，离子驻留时间100 ms。

1.4 数据分析

利用Analyst TF软件进行数据采集，PeakView和MasterView软件进行花青苷化合物的结构鉴定分析。基于一级质谱TOF-MS的精确质量数、同位素分布以及化合分子不饱和度等信息，利用PeakView软件中的FormularFinder功能，推测花青苷化合物可能的分子式；进一步基于二级质谱TOF-MS/MS产生的高分辨率、高准确质量数的碎片离子信息，结合花青苷质谱裂解规律，推测花青素苷元、糖基以及取代基的种类；综合考虑花青苷化合物极性及色谱洗脱顺序，参考相关文献和数据库（mass bank，dictionary of natural products，KEGG，HMDB），完成花青苷组分的结构鉴定；最后利用已有的标准物质对花青苷的定性结果进行验证。对于已鉴定的花青苷化合物，计算一级质谱中的提取离子色谱峰的峰面积，对蓝靛果忍冬中花青苷类化合物的相对含量进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 蓝靛果忍冬果实中花青苷的结构鉴定分析

利用已建立的UPLC-TOF-MS/MS方法，对蓝靛果忍冬果实中的花青苷提取物进行进样分析。采用反相色谱法对花青苷进行色谱分离，UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）为固定相，乙腈-水系统为流动相，添加0.1%甲酸（V/V）作为酸性添加剂，维持花青苷阳离子的稳定性，同时可以提高花青苷的色谱分离度，减少色谱峰拖尾现象[20-21]。

图1 3 种蓝靛果忍冬伊利亚特（a）、别列里（b）和格尔达（c）果实中花青苷提取物的总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatograms of anthocyanin extracts from three varieties of blue honeysuckle: Iliad (a), Berel (b) and Gerda (c)

由图1可以看出，利用TOF-MS的高分辨率特点，结合TOF-MS scan-IDA-product ion scan复合扫描模式，一次进样分析即可同时获得花青苷的一级质谱分子离子和二级质谱碎片离子的精确质量数，结合同位素分布比、质谱裂解规律、化合物极性及色谱洗脱顺序，并通过与文献[22-27]进行比对，在蓝靛果忍冬果实中共鉴定24 种花青苷类化合物，具体的结构鉴定结果见表2。其中矢车菊素-3-阿拉伯糖苷、矢车菊素-3-木糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-半乳糖酸木糖苷、矢车菊素-3-芸香糖苷、矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-槐糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-芸香糖苷和飞燕草素-3-葡萄糖苷10 种花青苷利用对照品完成了对定性结果的确证。此外，矢车菊素-3-木糖苷、矢车菊素-3-鼠李糖苷、矢车菊素-3-半乳糖酸木糖苷、矢车菊素-3,5-双半乳糖苷、矢车菊素-3-槐糖苷、矢车菊素-3-双己糖苷、矢车菊素-3-丙二酰己糖苷、芍药素-3-双己糖苷和飞燕草素-3-双己糖苷9 种花青苷为首次在蓝靛果忍冬果实中被发现。

表2 蓝靛果忍冬果实中花青苷的定性分析结果和提取离子色谱峰面积Table 2 Identification of anthocyanins and peak areas of the extracted ion chromatograms of anthocyanins in the fruits of blue honeysuckle

由表2可知，蓝靛果忍冬果实中花青苷含有矢车菊素、芍药素、飞燕草素和天竺葵素4 种苷元类型，表明蓝靛果忍冬花青苷的苷元类型丰富；此外，花青苷的存在形式包含单糖苷、双糖苷、酰基取代的花青苷和矢车菊素-3-己糖苷二聚体。其中单糖苷包含花青苷苷元3位取代的葡萄糖苷、阿拉伯糖苷、木糖苷和鼠李糖苷4 种形式；而双糖苷包含花青苷苷元3位取代的芸香糖苷、槐糖苷、半乳糖酸木糖苷、桑布双糖苷和双己糖苷，以及3,5位取代的双葡萄糖苷和双半乳糖苷7 种形式；酰基取代的花青苷主要为乙酰基和丙二酰基取代的花青素-3-己糖苷。本实验分别以单糖苷中的飞燕草素-3-葡萄糖苷、双糖苷中的矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷、酰基取代花青苷中的芍药素-3-乙酰基己糖苷为例，详细解析蓝靛果忍冬果实中这3 类花青苷的质谱行为和裂解规律，描述其质谱鉴定过程。

2.1.1 蓝靛果忍冬果实中花青素单糖苷的结构鉴定分析

花青苷在正离子模式下以阳离子形成存在，主要的分子离子峰为[M]＋，花青素单糖苷的二级质谱裂解模式主要为糖苷键的断裂，丢失单糖基团后生成花青苷苷元碎片离子[28]。飞燕草素-3-葡萄糖苷在正离子模式下的一级质谱图见图2a，分子离子峰为m/z465.102 4；其二级质谱图见图2b，通过3位糖苷键的断裂，失去一分子已糖脱水基团（－162.052 6 Da），产生主要的碎片离子m/z303.049 8，为飞燕草素苷元离子，推断该花青苷为飞燕草素-3-已糖苷；最后利用飞燕草素-3-葡萄糖苷标准品的进样分析，对比保留时间、同位素分布比、一级和二级质谱图，最终确定该花青苷为飞燕草素-3-葡萄糖苷。

图2 正离子模式下蓝靛果忍冬果实中飞燕草素-3-葡萄糖苷的一级（a）和二级（b）质谱图Fig.2 Mass (a) and tandem mass (b) spectra of delphinidin 3-glucoside in blue honeysuckle fruits in positive ion mode

依照图2花青素单糖苷的二级质谱断裂规律，蓝靛果忍冬果实花青苷提取物的TOF-MS/MS产物离子扫描中，得到的碎片离子含有m/z287.05、303.05、271.06、301.07，分别为矢车菊素苷元离子、飞燕草素苷元离子、天竺葵素苷元离子和芍药素苷元离子；丢失的单糖基团分别为阿拉伯糖基或木糖基（－132.042 Da）、葡萄糖基（－162.052 Da）和鼠李糖基（－146.058 Da），结合相关花青苷标准品，最终在蓝靛果忍冬果实中鉴定出7 种花青素单糖苷，分别为矢车菊素-3-阿拉伯糖苷、矢车菊素-3-木糖苷、矢车菊素-3-鼠李糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷和芍药素-3-葡萄糖苷。

2.1.2 蓝靛果忍冬果实中花青素双糖苷的结构鉴定分析

蓝靛果忍冬果实花青素双糖苷的二级质谱裂解模式主要为苷元和双糖之间的糖苷键断裂，失去双糖基团而产生相应的苷元碎片离子[29]。矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷在正离子模式下的一级质谱图见图3a，主要的分子离子峰为[M]＋（m/z611.161 4），其二级质谱图见图3b，通过3-位糖苷键的断裂，失去一分子己糖脱水基团（－162.052 3 Da），产生相应碎片离子m/z449.109 1；进一步发生5-位糖苷键的断裂，失去另一分子己糖脱水基团（－162.053 5 Da），生成矢车菊素苷元碎片离子m/z287.055 6，因此该花青苷被鉴定为矢车菊素-3,5-双己糖苷；最后利用矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷标准品的进样分析，对比保留时间、同位素分布比、一级和二级质谱图，最终确定该花青苷为矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷。依照上述花青素双糖苷的二级质谱断裂规律，最终在蓝靛果忍冬果实中完成了天竺葵素-3-芸香糖苷、矢车菊素-3-芸香糖苷和飞燕草素-3-双己糖苷等13 种花青素双糖苷的结构鉴定。

图3 正离子模式下蓝靛果忍冬果实中矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷的一级（a）和二级（b）质谱图Fig.3 Mass (a) and tandem mass (b) spectra of cyanidin 3,5-diglucoside in blue honeysuckle fruits in positive ion mode

2.1.3 蓝靛果忍冬果实中酰基花青苷的结构鉴定分析

蓝靛果忍冬果实中酰基花青苷的二级质谱裂解模式主要为苷元和酰基化糖基基团之间的糖苷键断裂，失去酰基化糖基基团而生成苷元碎片离子[30-31]。芍药素-3-乙酰基己糖苷在正离子模式下的一级质谱见图4a，主要的分子离子峰为[M]＋（m/z505.133 5），其二级质谱见图4b，通过3-位糖苷键的断裂，失去一分子乙酰基己糖脱水基团（－204.062 Da），生成芍药素苷元碎片离子m/z301.071 5，因此该花青苷被鉴定为芍药素-3-乙酰基己糖苷。由于本研究尚无法获得相关酰基花青苷的标准品，只能根据TOF-MS/MS中丢失的糖基基团的精确质量数推测为己糖苷，但无法明确具体的己糖类型。未来的研究中还需要通过标准物质、分析纯化以及核磁等技术手段完成蓝靛果忍冬果实中酰基花青苷准确的结构鉴定。依照上述质谱断裂规律，最终在蓝靛果忍冬果实中完成了矢车菊素-3-乙酰基己糖苷、矢车菊素-3-丙二酰己糖苷和芍药素-3-乙酰基己糖苷等3 种酰基花青苷的结构鉴定。

图4 正离子模式下蓝靛果忍冬果实中芍药素-3-乙酰基己糖苷的一级（a）和二级（b）质谱图Fig.4 Mass (a) and tandem mass (b) spectra of peonidin-3-acetylhexoside in blue honeysuckle fruits in positive ion mode

2.2 3 种蓝靛果忍冬果实中花青苷的比较分析

花青苷类化合物具有结构相似性，其质谱响应也具有相似性和可比性。通过一级质谱中花青苷的提取离子色谱峰峰面积比较分析不同品种蓝靛果忍冬果实中花青苷类的相对含量，结果见表2。3 种蓝靛果忍冬果实中花青苷类的组成存在明显差异，其中伊利亚特果实中含有花青苷种类最丰富，共检测到24 种花青苷；与伊利亚特相似，别列里果实中共检测到23 种花青苷，其中矢车菊素-3-双己糖苷未在别列里果实中被检测到；而格尔达果实中含有的花青苷种类最少，只检测到12 种花青苷。

3 种蓝靛果忍冬果实中花青苷总含量的比较见图5a，伊利亚特和别列里果实中花青苷的总含量显著高于格尔达，这与伊利亚特和别列里深红色果肉颜色，格尔达浅红色果肉颜色的表型相符合。由表2可知，3 种蓝靛果忍冬果实中主要的花青苷均为矢车菊素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷，这4 种花青苷含量的总和分别占伊利亚特、别列里和格尔达花青苷总含量的94.9%、94.1%和99.1%，它们相对含量的比较分析见图5b。矢车菊素-3-葡萄糖苷是蓝靛果忍冬果实中相对含量最高的花青苷，分别占伊利亚特、别列里和格尔达花青苷总含量的72.4%、70.9%和89.7%；含量其次较高的是芍药素-3-葡萄糖苷，分别占伊利亚特、别列里和格尔达花青苷总含量的10.1%、9.5%和7.1%；此外，矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷的含量相对较少，则分别占伊利亚特花青苷总含量的7.4%和5.0%，占别列里花青苷总含量的6.7%和7.0%，占格尔达花青苷总含量的0.7%和1.6%。因此，蓝靛果忍冬果实中主要的花青苷为矢车菊素类和芍药素类花青苷，而天竺葵素类和飞燕草素类花青苷则含量较低。本研究得到的蓝靛果忍冬果实花青苷的组成及其相对含量的分析结果均符合相关的文献报道[32-33]，表明本实验所建立的植物花青苷分析方法具有很好的准确性。此外，通过3 种不同品种蓝靛果忍冬果实中花青苷的比较分析可知，与格尔达相比较，伊利亚特和别列里果实中含有种类丰富且含量较高的花青苷。

图5 3 种蓝靛果忍冬果实中总花青苷（a）和主要花青苷（b）相对含量的比较分析Fig.5 Comparative analysis of the relative contents of total (a) and major individual (b) anthocyanins in the fruits of three varieties of blue honeysuckle

3 结 论

本实验以伊利亚特、别列里和格尔达为研究对象，利用UPLC-TOF-MS/MS技术，对这3 种蓝靛果忍冬果实中的花青苷组分进行分析，详细阐述了花青苷的质谱行为和二级质谱裂解规律，共鉴定出24 种花青苷，其中9 种花青苷为首次在蓝靛果忍冬果实中被鉴定。3 种蓝靛果忍冬果实中花青苷的组成和相对含量不同，在伊利亚特、别列里和格尔达果实中分别检测到24、23、12 种花青苷，并且伊利亚特、别列里果实中含有的花青苷总量和每一种花青苷的相对含量均明显高于格尔达，说明不同品种的蓝靛果忍冬果实中花青苷存在多样性和差异性。本实验结果为进一步分析蓝靛果忍冬花青苷类物质的遗传机制，以及培育富含花青苷的蓝靛果忍冬新品种提供重要的理论依据。