脂蛋白肾病肾脏组织油红O染色方法改良

马依依，屈 磊，张 帆，喻小娟，王素霞，杨 莉

脂蛋白肾病是一种罕见的由ApoE基因突变引起的常染色体隐性遗传疾病。ApoE为低密度脂蛋白受体，其突变不仅可引起血清中β脂蛋白前体、β脂蛋白和ApoE升高，还可导致Ⅲ型高脂血症，而Ⅲ型高脂血症患者的肾小球损伤病理改变与脂蛋白肾病相同[1-2]。该病突出表现为肾小球毛细血管腔内脂质沉积，肾小球毛细血管腔内的脂蛋白栓在经10%中性福尔马林固定、石蜡切片，仅在PAS染色下有淡染色，确诊脂蛋白肾病需冷冻组织油红O或苏丹红染色阳性，该阳性物质为脂蛋白[3-4]。因此，针对脂蛋白栓的染色在诊断脂蛋白肾病中非常重要。本实验通过对比三种不同油红O染色方法(粉末油红O、经60%异丙醇处理的粉末油红O、改良版油红O)，探索脂蛋白肾病患者肾组织油红O染色的较优染色方法，为临床病理诊断提供快速且准确的病理技术服务。

1 材料与方法

1.1 标本选取2018～2019年北京大学第一医院肾内科临床病理确诊的2例脂蛋白肾病。肾穿刺活检冷冻组织5 μm厚切片。

1.2 配制试剂油红O染液：0.05 g油红O粉末(Sigma Aldrich)室温溶于100 mL 50%乙醇，过滤。改良油红O染液：按照试剂盒说明书将Oil red O stain A与Oil red O stain B(Solarbio)以3 ∶2比例混合均匀，室温静置10 min。

1.3 方法

1.3.1油红O染色法 (1)将冷冻切片取出室温放置20 min。(2)将恢复至室温的冷冻切片浸入配制的油红O染液中浸染15 min。(3)去离子水终止反应。(4)滴加苏木精至完全覆盖肾组织，滴染2 min。(5)去离子水洗。(6)浸入1%碳酸锂5 s进行返蓝。(7)甘油封片，光镜下观察。

1.3.2经60%异丙醇处理的油红O染色法 (1)将冷冻切片取出室温放置20 min。(2)将恢复室温的冷冻切片浸入60%异丙醇20～30 s进行预处理。(3)预处理后，直接将冷冻切片浸入事先配置好的油红O染液中浸染15 min。(4)插入60%异丙醇中洗去浮色。(5)滴染苏木精2 min。(6)去离子水中浸洗多余浮色。(7)浸入1%碳酸锂5 s进行返蓝。(8)甘油封片，光镜下观察。

1.3.3改良油红O染色法 (1)将冷冻切片取出室温放置20 min。(2)将恢复至室温的冷冻切片浸入60%异丙醇20～30 s进行预处理。(3)预处理后，直接将冷冻切片浸入事先配制好的改良油红O染液中，密闭染色15 min。(4)将冷冻切片浸入60%异丙醇中洗去浮色。(5)浸入去离子水中洗去异丙醇。(6)滴染苏木精2 min。(7)去离子水中浸洗多余浮色。(8)浸入1%碳酸锂返蓝5 s。(9)甘油封片，光镜观察。

2 结果

油红O染色结果显示：肾小球毛细血管腔内、系膜区可见淡染橙红色的脂滴(图1A)。经60%异丙醇处理油红O染色结果显示：肾小球毛细血管腔内、系膜区可见浅染橘色的脂滴，细胞核呈淡蓝色，轮廓较粉末油红O清晰(图1B)。改良油红O染色结果显示：肾小球毛细血管腔内、系膜区和部分肾小管上皮细胞胞质内可见深染红色的脂滴，明显区别于呈淡染的蓝色细胞核，且边界清晰(图1C)。

ABC图1 A.油红O染色;B.经60%异丙醇处理的油红O染色;C.改良油红O染色

3 讨论

脂蛋白肾病患者主要为亚裔人群(中国人、日本人)[5]，男性多于女性，男 ∶女为1.5 ∶1；主要见于成人，诊断时中位年龄31.5岁，但儿童也可见[6]；临床主要表现为蛋白尿，可出现肾病综合征，并呈激素抵抗。其病理改变主要为光镜下肾小球毛细血管腔内脂质沉积、系膜细胞和基质增生，可出现系膜溶解，毛细血管壁增厚、断裂。福尔马林固定组织制备的石蜡切片在光镜下仅可见毛细血管腔内淡染“血栓”，其原因为石蜡切片经二甲苯和无水乙醇浸泡后脂质已溶解消失。因此，确诊脂蛋白肾病需在冷冻切片上显示毛细血管腔内脂滴。具体方法有油红O、尼罗红、苏丹红、锇酸染色；其中油红O与脂质的亲和力较强、着色较深，显示脂滴位置清晰，与组织背景区分明确，油红O染色比其他染色方法稳定、操作简单、可重复性强[6-10]，因此临床最常用油红O染色帮助诊断脂蛋白肾病。

冷冻切片用于免疫组化染色通常厚度为2～3 μm，本实验油红O染色肾组织冷冻切片厚度为5 μm，目的是尽可能多地获取脂质，染色效果更明显，形态更清晰。本实验三种油红O染色方法皆可用于脂蛋白肾病的诊断，但在染色效果上有所差异。与油红O染液相比，改良油红O染液与经60%异丙醇处理油红O染液两种染色肾组织中脂滴位置明确、轮廓清晰，未见明显移位，肾脏组织细胞核颜色鲜艳且轮廓清晰，并且切片背景更干净，无明显的橙黄色背景。油红O染液脂滴位置相对明确，但有明显移位且界限不清，细胞核颜色暗淡且轮廓模糊，组织背景较高且颜色偏橙黄色。其效果存在差异的原因可能与60%异丙醇预处理有关，异丙醇除起到固定脂质的作用外，还可消除非特异染色背景。

三种染色方法对于脂滴的着色程度也有明显不同，改良油红O染色脂滴呈鲜艳的红色，油红O染色脂滴呈橙色，经60%异丙醇处理油红O染色则为淡染的橘色。原因可能为经60%异丙醇处理油红O染液中的异丙醇溶解组织中部分脂肪、沉积量减少有关。改良油红O染色虽然也经60%异丙醇处理，组织中脂肪虽部分溶解，但改良油红O染液中可能含有与异丙醇高度亲和的成分，从而使经过异丙醇预处理的脂质呈鲜艳的红色。

综上所述，对于肾脏冷冻组织，改良油红O染液染色方法明显优于油红O染液和经60%异丙醇处理的油红O染液，其原因可能与冷冻组织是否经过60%异丙醇预处理以及染液中是否含有与异丙醇高度亲和的成分有关。改良油红O染液染色方法稳定性高，操作简单，染色鲜艳清晰，非特异性背景低，为脂蛋白肾病的病理诊断提供了稳定且可靠的染色技术。