高效液相色谱法测定牙膏中3种苯扎氯铵同系物

郑国灿 ,徐亚龙 ,董浩然 ,赵 爽 ,宫敬禹

(1.重庆大学分析测试中心,重庆 401331; 2.重庆大学化学化工学院,重庆 401331;3.重庆大学材料科学与工程学院,重庆 400044; 4.重庆登康口腔护理用品股份有限公司,重庆 400025)

苯扎氯铵是一种季铵盐类阳离子杀菌剂,是由正烷烃基取代的二甲基苄基氯化铵的同系物组成,主要以十二烷基二甲基苄基氯化铵(C12-BAC)、十四烷基二甲基苄基氯化铵(C14-BAC)和十六烷基二甲基苄基氯化铵(C16-BAC)为主。3种同系物具有不同的杀菌特性,C12-BAC 对酵母菌和真菌具有抑制作用,C14-BAC和C16-BAC 对革兰氏阳性菌和阴性菌具有抑制作用[1],3种同系物往往配合使用,被广泛应用于医用产品、化妆品、日化用品中。苯扎氯铵对眼睛、皮肤具有强烈的刺激性,过量使用会引起人身伤害,GB 22115－2008《牙膏用原料规范》和《化妆品安全技术规范》(2015年版)规定化妆品及牙膏中苯扎氯铵的限量均为0.1%(质量分数)。

目前苯扎氯铵的测定方法主要有紫外分光光度法[2]、毛细管电泳法[3-4]、高效液相色谱法[5-11]、液相色谱-串联质谱法[12-13]等。紫外分光光度法易受样品基质的干扰,且只能测定苯扎氯铵总量;毛细管电泳法试剂消耗量少,但方法的稳定性易受样品介质和基质的影响;液相色谱-串联质谱法仪器设备昂贵,但灵敏度较高,适用于禁用苯扎氯铵产品的分析;高效液相色谱法因其仪器设备具有普适性被广泛采用,其灵敏度适合化妆品[5,8]、包装材料[7]、日化用品[9]、医用产品[10-11]等限用苯扎氯铵产品的测定。在高效液相色谱法中,常用C18柱[7,9,11]、氰基(CN)柱[6,8,10]、强阳离子(SCX)柱[5]作为分离色谱柱,其中CN 柱和SCX 柱,因其对苯扎氯铵具有较好特异性而被经常采用,而C18柱对苯扎氯铵的特异性较差,往往需添加离子对试剂作为流动相,以改善峰形和选择性。鉴于目前牙膏中苯扎氯铵含量的测定方法报道较少,本工作采用高效液相色谱法,以CN 柱分离,利用二极管阵列检测器测定牙膏中C12-BAC、C14-BAC和C16-BAC 等3 种苯扎氯铵同系物的含量,本方法前处理简单,灵敏度和选择性较好,可为牙膏质量安全监管提供技术方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

岛津LC-20A 型液相色谱仪,配二极管阵列检测器(DAD);H1850R 型冷冻离心机;VORTEX 2型涡旋振荡器;DY-10-240DTL型超声波清洗机。

3种苯扎氯铵同系物的标准储备溶液:10.0 g·L－1,分别称取3 种苯扎氯铵同系物的对照品各1.000 0 g,以适量甲醇溶解后,用甲醇定容至100.0 mL,于4 ℃保存。使用时用甲醇稀释至所需质量浓度。

C12-BAC、C14-BAC 和C16-BAC 对照品的纯度不小于99.5%;所用试剂均为色谱纯;试验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

GL Sciences CN-3色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱温30 ℃;检测波长260 nm;进样量10μL;流量1.0 mL·min－1。流动相为乙腈与0.1 mol·L－1乙酸铵溶液以体积比1∶1组成的混合液;等度洗脱。

1.3 试验方法

称取市售牙膏样品1.000 0 g于50 mL 尖嘴离心管中,加数颗玻璃珠,加甲醇10 mL,涡旋振荡2 min,使牙膏完全分散,再超声提取10 min,在8 000 r·min－1转速下离心5 min,上清液经0.45μm 有机微孔滤膜过滤后,取滤液按色谱条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按色谱条件对3种苯扎氯铵同系物的混合标准溶液进行测定,色谱图见图1。

图1 3种苯扎氯铵同系物混合标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of 3 homologues of benzalkonium chloride

按试验方法对空白样品和加标样品进行分析,色谱图见图2。

由图1和图2可见:在色谱条件下,3种苯扎氯铵同系物均达到完全分离,峰形良好。

2.2 提取溶剂及提取方式的选择

苯扎氯铵易溶于水、醇等极性溶剂,而牙膏基质比较复杂,选择提取溶剂时需要充分考虑牙膏的溶解性和分散性。

图2 样品的色谱图Fig.2 Chromatograms of the samples

试验中采用水、甲醇、乙醇、乙腈等4种提取溶剂对牙膏阳性样品进行提取。试验结果表明:水能够完全分散牙膏样品,牙膏样品溶液黏稠;甲醇能部分溶解牙膏样品,基质中碳酸钙等无机盐不溶解,牙膏样品溶液的分散性较好;乙醇也能部分溶解牙膏样品,牙膏样品溶液的分散性较甲醇作为提取溶剂时牙膏样品溶液的分散性差;乙腈作为提取溶剂时,牙膏样品溶液的分散性最差,牙膏样品成坨状。苯扎氯铵的提取效率由大到小依次为甲醇、水、乙醇、乙腈。试验选择提取溶剂为甲醇。

采用涡旋振荡和超声提取相结合的方式对苯扎氯铵进行提取,提取时加入玻璃珠,使牙膏样品进行充分分散与溶解。

试验中考察了牙膏样品的涡旋时间和超声时间对苯扎氯铵提取效率的影响。结果表明:牙膏样品涡旋振荡2 min、超声提取10 min就能进行充分的分散与溶解,苯扎氯铵的提取效率最高。试验中牙膏样品涡旋振荡2 min、超声提取10 min。

2.3 色谱条件的选择

2.3.1 色谱柱

苯扎氯铵的分离可以采用C18柱、CN 柱、SCX柱等不同类型的色谱柱。使用C18柱时,流动相需要添加庚烷磺酸钠作为离子对试剂[7,11],或者加入三乙胺作为扫尾剂[9],以改善峰形和选择性。为了简化流动相体系,试验以乙腈-乙酸铵体系作为流动相(等度洗脱),考察了CN 柱、SCX 柱对3种苯扎氯铵同系物的分离情况。

结果表明:采用CN 柱、SCX 柱时,3种苯扎氯铵同系物的分离情况以及峰形等比较类似。试验选择色谱柱为CN 柱。

2.3.2 流动相

根据文献[10],试验采用乙腈-乙酸铵体系作为流动相(等度洗脱)。试验首先用乙酸调节流动相的酸度,考察了流动相的酸度对样品中杂质和3种苯扎氯铵同系物分离的影响,结果见图3。

图3 流动相的酸度对样品中杂质和3种苯扎氯铵同系物分离的影响Fig.3 Effect of acidity of mobile phase on separation of impurities and 3 homologues of benzalkonium chloride in sample

由图3 可知:随着pH 的增加,样品中杂质和3种苯扎氯铵同系物的分离度越来越大;当pH 增加至6～7时,样品中所有杂质的保留时间均小于3种苯扎氯铵同系物的保留时间,3种苯扎氯铵同系物的测定完全不受杂质干扰。这可以确定在接近中性的条件下杂质的保留行为和3种苯扎氯铵同系物的保留行为有较大的区别。为了进一步简化流动相的配制,试验选择流动相的pH 约为7,即流动相中不加乙酸。

试验其次考察了流动相中乙腈的比例对样品中杂质和3 种苯扎氯铵同系物分离的影响。结果表明:乙腈的比例从45%增至65%(以5%幅度递增)时,样品中杂质和3种苯扎氯铵同系物均能完全分离,即样品中杂质不干扰3种苯扎氯铵同系物的分离;乙腈的比例大于65%时,3种苯扎氯铵同系物不能完全分离。由试验结果还可知:乙腈的比例对3种苯扎氯铵同系物的保留时间和峰形有较大的影响,乙腈比例越高,3种苯扎氯铵同系物的保留时间越短,分离度也变小,特别是杂质峰与C12-BAC 的分离度。流动相中乙腈的比例为50%,55%,60%时,3种苯扎氯铵同系物的保留时间和分离度均比较理想。试验选择流动相中乙腈的比例为50%。

试验最后考察了乙酸铵的浓度对样品中杂质和3种苯扎氯铵同系物分离的影响。结果表明:随着乙酸铵浓度的增大,3种苯扎氯铵同系物的分离度逐渐减小,但是峰形越来越好,保留时间越来越小,其与样品中干扰峰的分离度也越来越小;乙酸铵的浓度为0.1 mol·L－1时,3种苯扎氯铵同系物的峰形较对称。试验选择乙酸铵的浓度为0.1 mol·L－1。

2.3.3 柱温

柱温较高能减少分析时间,但柱温越高,目标物的分离度越小。试验考察了柱温依次为20,25,30,35,40 ℃时,3种苯扎氯铵同系物的分离情况。结果表明:柱温为20,25,30 ℃时,3种苯扎氯铵同系物的峰形基本差异不大,随着柱温的升高,3种苯扎氯铵同系物的分离度小幅减小,但都达到基线分离,整体保留时间逐渐变小;柱温为35 ℃时,C16-BAC的峰形开始稍稍变差;柱温为40 ℃时,C16-BAC 的峰形变为平台峰。因此,柱温不应超过35℃。由试验结果还可以看出:柱温较低时不会影响3种苯扎氯铵同系物的分离度和峰形;柱温越低,3种苯扎氯铵同系物的保留时间越长。试验选择柱温为30℃。考虑到实际的试验条件,若仪器没有配备柱温箱或者柱温箱没有制冷的功能,应控制环境温度不超过35 ℃。

2.4 标准曲线、检出限和测定下限

按色谱条件对5,10,20,50,100,200,500 mg·L－1的3种苯扎氯铵同系物的混合标准溶液系列进行测定,并绘制标准曲线。结果表明:3种苯扎氯铵同系物的质量浓度均在5～500 mg·L－1内与其对应的峰面积呈线性关系,线性回归方程和相关系数见表1。

根据3倍信噪比计算方法的检出限(3S/N),根据10倍信噪比计算方法的测定下限(10S/N),结果见表1。

表1 线性回归方程、相关系数、检出限和测定下限Tab.1 Linear regression equations,correlation coefficients,detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度和回收试验

按试验方法对空白牙膏样品(样品基质依次为碳酸钙、磷酸二氢钙、二氧化硅)进行加标回收试验,加标量为100,1 000,2 000 mg·kg－1,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表2。

由表2可知:回收率为97.4%～107%,RSD 为0.21%～5.2%。

2.6 样品分析

按试验方法对不同基质的20种市售牙膏样品进行分析,其中6种牙膏样品检出3种苯扎氯铵同系物,其余14种牙膏样品均未检出3种苯扎氯铵同系物,所检阳性样品中3种苯扎氯铵同系物的含量均未超过国家标准1 000 mg·kg－1的限量,均为合格。

本工作建立了测定牙膏中3种苯扎氯铵同系物含量的HPLC-DAD 方法。本方法前处理简单、分析快速,可用于实际样品分析,易在基层检测单位推广使用。

表2 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)