高含油量油菜品系遗传多样性分析

郭凯红，赵卫国，王晓东，李殿荣，田建华，李保军，陈文杰，尚丽平，张立坚，罗 斌，王 灏，栗茂腾

(1.陕西省杂交油菜研究中心，陕西 杨凌 712100；2.江苏农业科学院 经作所，江苏 南京 210014；3.华中科技大学 生命科学与技术学院，湖北 武汉 430074)

油菜是我国的第一大油料作物，种植面积常年维持在666.7万hm2左右，年产量超过1 400万t[1, 2]，菜籽油产量占国产油料作物产油量的55%以上[3]。然而，我国食用油对外依存度依然很高，2017年的进口比例已达69.2%，进口油菜占国内市场的份额不断增加[4]，因此，在现有种植面积上，提高油菜籽含油量，选育高含油量品种应是缓解我国菜籽油供需矛盾的有效途径。 近年来，通过常规育种结合现代生物技术等培育的油菜种质资源含油量不断提升，如华中农业大学傅廷栋[5]、江苏农科院傅寿仲[6]、中国农科院王汉中[7]等先后选育出了一批含油量超过50%的新品系。本研究团队长期致力于高油种质创新和育种研究应用，通过对国内外不同遗传背景的油菜品系进行小孢子培养、基因聚合和生态穿梭获得了一大批含油量50%以上、部分达到60%以上的高油种质资源，并育成了含油量超过50%的我国第一个杂交油菜品种“秦杂油4号”[5]。我国有着丰富的高含油种质资源，但对高油种质资源之间的遗传多样性却鲜有研究，品种间的亲缘关系也不明确，优良的高油亲本不能被有效充分利用。因此研究高油种质资源间的遗传多样性，拓宽高油品种的遗传基础，对高油育种亲本的选择和杂交组合选配具有重要的指导意义。

SRAP分子标记分布均匀、重复性好、简单易操作、花费少，已被广泛应用于油菜等作物的遗传育种研究[8]。文雁成、王汉中等[9]用 SRAP 标记分析中国甘蓝型油菜品种的遗传多样性和遗传基础进行分析，发现我国近60%的甘蓝型油菜品种遗传多样性较匮乏。张羽等[10]用SRAP 标记结合 SSR 标记对陕南地区油菜主要育种材料的遗传多样性进行分析，结果显示56 份该地区甘蓝型油菜自交系中多数材料亲缘关系较近，在育种中需要创新种质资源。陈玉峰等[11]用SRAP标记对甘蓝型油菜品种进行含油量的遗传多样性进行研究，表明高含油量供试品种间存在着较大的遗传差异。王燕惠等用[12]SRAP分子标记对国内外43份甘蓝型油菜材料进行遗传多样性分析，也发现参试材料差异较大，彼此之间存在不同程度的亲缘关系。对甘蓝型油菜育种材料遗传多样性的研究较多，但目前还未见对甘蓝型油菜高油种质(含油量高于50%)群体间的遗传多样性进行详细地分析报道。

笔者研究以不同来源的54份高油油菜品系为材料，利用 SRAP 分子标记技术对其遗传关系进行分析，以期理清高含油量油菜种质资源间的分子遗传关系，为后续亲本选配和杂种优势预测提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料由陕西省杂交油菜研究中心提供，共54份，来源于国内外不同地区，通过聚合杂交、小孢子培养、生态、黄籽、高油杂交优势等育种技术多年创制而成。

1.2 品质检测

供试材料的含油量用德国BRUKER公司的PC-120核磁共振仪(NMR)进行测定，其测定方法参照王竹云等[13]。油菜籽粒的芥酸、硫甙含量用近红外反射光谱仪(NIRS)测定，由陕西省杂交油菜研究中心品质分析检测室检测，具体方法参照陈文杰等[14]。

1.3 SRAP标记检测

1.3.1 DNA的提取 油菜总DNA的提取采用王灏等优化后的SDS法[15]。提取好的DNA，溶解在 TE 溶液中，用核酸分析仪测定其浓度，保存在-80℃ 备用。

1.3.2 SRAP引物组合选择及PCR扩增 SRAP引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，通过引物组合筛选比较，从中选取多态性丰富的SRAP引物组合8对。

PCR扩增反应 反应体系：2 μl 10×Buffer(含 20 mmol·L-1Mg2+)、0.5 μl 10 mmol·L-1dNTPs、上/下游引物(20 μmol·L-1)各1μL、2 μL DNA 模板(约 30 ng)、0.4 U Taq DNA 聚合酶，加ddH2O 至20 ul。反应程序为94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 1 min，35 ℃复性 1 min，72 ℃延伸 1 min，共 5 个循环；94 ℃变性 1 min，58 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，共 30 个循环；72 ℃延伸 10 min；4 ℃保存。

1.4 数据统计与分析

对54份高油材料进行SRAP扩增，将电泳图谱上清晰的条带记为“1”，无条带的记为“0”，构建 0/1 矩阵图。利用POPGENE 32 软件对SRAP 分子标记的结果进行包括引物扩增总条带数(TNB)、多态性条带数(NPB)、多态性条带百分比(PPB)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样性指数(H)、Shannon’s 信息指数(I)和多态性信息含量(PIC)等遗传多样性参数分析。用 NTSYS-pc2.10软件中的中 DICE 法计算遗传相似系数，用非加权平均法(UPMGA)进行聚类构建。

2 结果与分析

2.1 高含油量油菜品系相关性状分析

54份高含油量油菜品系材料背景来源、含油量、芥酸、硫苷、种皮色泽等相关性状见表1。从表1可以看出，高油品系来自加拿大、韩国、英国和我国陕西、湖北、贵州、青海、西藏等不同地域背景材料。通过对不同背景来源的高油品系进行分析，含油量49.98%～58.05%，其中55%以下材料38份，大于55%的材料16份。

芥酸是油分构成中的一种脂肪酸，是重要的品质性状，笔者研究的高油品系中高芥酸材料22份，低芥酸材料32份(占59.62%)。在不同高油构成中，含油量55%以下的低芥品系占52.63%，55%以上品系中低芥酸占到75%，表明经过高油和低芥酸目标改良选择，在低芥酸的背景下同样可以获得高油，芥酸和含油量的相关性可通过遗传改良打破。低芥酸的高油种质成为高油种质创新的必要要求。硫苷是油菜又一重要的品质性状指标，其主要存在于籽粕中。笔者研究的高油品系中低硫苷品系有43份，占到79.63%，不同程度高油中，55%以下30份，55%以上13份，分别占比78.95%和81.25%。该数据表明低硫苷改良和高油没有相关性，是不同的遗传性状方向。对照双低目标，其品系双低率为51.85%。

粒色深浅影响种皮厚度和种皮在种子中的占比，进而影响含油量。笔者研究的高油品系中，黑粒、五花中间色和黄粒的材料份数分别为13、13和28，各占比例为24.07%、24.07%和51.85%，黄籽材料数量居多。而含油量在55%以下的占比为黑、中、黄分别为28.95%、23.68%和47.37%；55%以上的对应比例则为12.5%、25%和62.5%，表明随着含油量的提升，黑籽深色种质数量在减少，五花、黄色浅色种皮种质数量在增多。按黑粒、五花、黄粒色统计平均含油量是52.75%、53.27%、53.58%，黄粒相对较高[5]，体现了高油和粒色具有显著的相关性。同时，在不同粒色中皆有较高含油量的种质，表明除粒色外，其种仁的含油量起到了更重要的贡献作用，高油的形成是油分贡献基因协作共同遗传表达的结果。

表1 高含油材料品质分析结果

续表1 高含油材料品质分析结果

2.2 高油油菜品系的SRAP结果分析

研究从100多对SRAP引物组合中筛选出具有条带清晰、稳定性高、多态性丰富的引物组合8对。通过8对引物组合对54个材料的SRAP分析，共获得电泳条带113个，各引物扩增条带数目分别在 8～26 之间，平均14.13个。其中多态性条带83个，Rem12/Fme3组合扩增的多态性位点最多，达到17个，Rem14/Fme8组合扩增多态性位点最少，仅为5个，平均多态条带10.38个，多态率为73.45%。 这表明SRAP 标记对油菜种质资源遗传背景具有较强的鉴别能力，适合用于遗传分析的研究。

利用POPGENE 32 软件对SRAP 分子标记的结果进行处理，发现有效等位基因数(Effective number ofalleles，Ne)的变异范围为 1.45～2.0，平均为 1.74；Nei’s基因多样性指数(Neil’s sgenediversity，H)分布在1.28～1.69，均值为1.46；Shannon’s 信息指数(Shannon’s information index，I)介于 0.17～0.4，平均值为0.27。当多态性信息含量PIC(Polymorphism information content)>0.5时，该基因座为高度多态基因座；0.25

表2 高含油材料 SRAP 标记遗传多样性参数

2.3 高含油量油菜品系的聚类分析

根据上述SRAP分析结果，计算54份高含油量油菜品系之间的遗传相似系数，利用UPGMA法进行聚类分析，构建树状聚类图(图1)。聚类图中的油菜品系编号与表1的油菜品系编号一致。聚类结果显示：54份材料的遗传相似系数在0.71～0.98之间，在相似性系数为0.73时，可将供试品系分为三大类，第一类为油研9号和23569两份材料构成，第二类是中油杂2号一个品系，剩余51份材料构成最大的第三类群，占比94.44%，表明第一类和第二类的3份材料与其他资源遗传关系相对较远。在相似性系数0.78处，可将供试材料分为6个类群，其中I、II类和上面一致，第三类再被分成III、IV、 V、VI四类，该分类更能详细地对所选资源进行分析、充分说明问题。

依照相似性系数0.78处的分类，I类有23569和油研9号两份材料，II类有中油杂2号1份材料、III类西藏35单个材料、IV类由大白菜DW08和L45两材料构成，四大类共有6份材料，占总材料数的11.11%，分别由加拿大、我国的贵州、湖北、西藏和陕西的甘蓝型油菜资源背景以及白菜型油菜源选育而来，体现了地域和亚种间资源背景的特异性，其遗传距离相对较远。第V类有38份材料，是最大的类群，可分成A、B、C、D 4个亚类，加拿大的23560单独在A亚类；春陕2B、440-1-87和9801三材料在B亚类；平陆芥菜/A74、Altex/864B、加曼42等18份聚在C亚类，其中黄粒14份，双低品质11份，含油量较高；L03-29、西藏69、青9917等16份材料被聚在D亚类，不同种皮色的材料数接近(黑∶中∶黄=5∶6∶5)，含油量低于55%的材料居多，有13份。第VI类有10份材料，包括中油821选、7794-54(无花瓣)、Slovx、韩2、陕3B等，黑色种皮材料5份，黄色材料4份，中间色材料1份，绝大多数材料油低于55%。该类可分成两个亚类，21H混-5、start/1666B-1和加0023622三个双低材料为一亚类，其他7份为另一亚类。

3 讨论

含油量是油料作物-油菜最重要的性状之一，提高含油量始终是油菜品种选育的重点目标，其中的关键无疑是高油种质创新。近年来，通过各种常规和现代生物技术结合，外加核磁共振仪、近红外仪等无损伤快速品质测定技术的应用，使大量高油种质创新及筛选成为可能，有力地促进了高油种质创新效率。笔者研究所选高油材料的含油量多年表现稳定且最高接近60%的材料，材料来自不同国别和我国主要油菜主产区的不同品种(系)，有自然演化的品种(系)，有人工合成和亚基因组间杂交的品种(系)，生态类型有春性、冬性和半冬性，品质性状有双低、单低和双高的，育性背景有与GMS、CMS杂优利用紧密相关的对应保持系、恢复系种质，也有育种目标特殊性状的资源，如紧凑株型、大粒、角果上挺、黄籽等，其中很多资源是我国的重要推广品种或重要品种的亲本以及国际上的一些重要资源，性状表现具有较突出的特异性、稳定性和一致性，材料选择具有典型性和代表性。

种质资源的丰富度、亲本组合遗传关系的远近以及亲缘系数的大小等遗传背景是改善作物性状最重要的因素，因此了解种质资源的遗传多样性十分有必要。前人已经利用SRAP分子标记技术对国内甘蓝型油菜种质资源进行了遗传多样性研究。臧珊等[16]在研究甘蓝型油菜骨干亲本的遗传多样性时，也发现SRAP标记较少SSR更有优势，扩增出的多态性条带更多，多态率更高。王燕惠等[12]通过对国内外43份甘蓝型油菜材料进行遗传多样性分析，多态性比率为52.5%，平均每对引物为3.8个多态性位点。张书芬等[17]采用SRAP标记对甘蓝型油菜品种的多态性进行分析，平均多态性条带5.8条，每对引物组合产生的多态性带的比例为18.75%～38.89%，平均为28.23%。笔者研究也使用该方法对高油种质间的遗传多样性进行了分析，SRAP结果显示平均多态性条带10.38，平均多态率为73.46%，平均每对引物的多态性位点为14.13个，平均多态率和多态位点远高于张书芬[17]、王燕惠[12]等，说明供试材料多态性较为丰富。

基于SPAP的聚类分析将54份材料分为6大类群，各类群材料没有与地域来源、含油量、粒色、品质等性状呈现出单一的指向性关系，但仍有较为明显的特征和趋势性规律，如当遗传系数为0.78时，75%的黄籽材料都被聚类到第Ⅴ类群，说明黄籽材料背景具有较近的遗传关系，这与薛汉军[18]等研究结果一致。笔者研究中，黄籽极高油(55%以上)、黄籽普通高油(50%～55%)、黑籽极高油、黑籽普通高油也分别分布在对应亚群中，尤其黄粒极高油除start/1666B-1外均分在Ⅴ类群中。众多研究表明，种质资源聚类与地理来源密切相关[19]，但笔者研究通过对聚类分布的地域因子进行分析，发现该因素对类群分布的贡献率较小，具体表现为同一地域来源的材料有的聚为一类，有的分属不同的大类或亚类，而部分不同地域的材料却被分在一起，与叶威等[20]等研究结果有差异，这是因为育种材料或品种本身就是一个各种优良性状的复杂聚合，同一地域来源的材料，其遗传背景并不一定简单一致。此外，远源背景种质表现也各有不同，白菜源的大白菜DW08/K407和大多数材料距离较远，而芥菜源的平陆芥菜/A74和亚基因组置换材料孟晚C-64并没有表现出与其他高油材料较远的遗传关系，这可能与后续改良过程中选择的倾向性有关，本实验中所选的高油材料品质性状有双高低、单低和双高，类群划分与芥酸、硫苷含量的高低无明显规律，因而高油和芥酸、硫苷的关联性相对较低，可能主要受育种选育目标影响。最终聚类结果是DNA水平的差异表现，是各种性状基因背景的综合反映，对应在类群与性状的关系上是一种多性状交互关联在一起形成的复杂综合体现。因此，高油育种应挖掘和利用遗传关系较远的、多样性较高的优良品系，拓宽遗传基础，为油菜高油品种的选育提供指导方向。