养阴化瘀解毒方促进结肠癌HCT116细胞凋亡的实验研究

朱 静,严小军,刘红宁,叶依殷,尚广彬

(江西中医药大学江西省中医病因生物学重点实验室中医基础理论分化发展研究中心,中国江西南昌330004)

结直肠癌是全球发病率居第三位、死亡率居第二位的恶性肿瘤[1],手术、放疗和化疗是西医临床癌症治疗的三大常规疗法,但术后高复发率和病灶易转移导致患者生存时间过短和生存质量不高[2～3]。传统医学认为,结肠癌是机体在正气内虚的基础上,痰浊、瘀血等互结而形成的一种本虚标实、虚实夹杂的疾病[4],古籍中多称之为“肠风”“脏毒”“肠蕈”等,中医临床根据病因病机处方遣药,治疗上多采用恢复人体正气、养肝肾之阴、化瘀解毒、清利肠道之法。养阴化瘀解毒方(Yangyin Huayu Jiedu Decoction,YYHYJDD)是全国名中医张小萍教授临床使用的验方,其在预防和治疗结肠炎方面取得了一定的疗效[5]。基础研究证明YYHYJDD可促进病变细胞凋亡,从而逆转小鼠结肠癌癌前病变和上皮内瘤变,但具体机制尚不清楚[6]。本实验初步探究了YYHYJDD含药血清对结肠癌HCT116细胞凋亡的影响,以期为临床治疗结肠癌提供理论和实践支持。

1 材料与方法

1.1 药物制备

YYHYJDD所需药材[6]:炒白芍20 g、败酱草20 g、茯苓 15 g、党参 20 g、黄芩 10 g、黄连 6 g、当归 10 g、炒白术 10 g、防风 6 g、木香 6 g、大黄 6 g、三七6 g、肉桂3 g、炙甘草6 g,购自江西省中医院(批号:2017101102),均由江西中医药大学中药鉴定室鉴定,符合《中华人民共和国药典》2015年版。取药后先用清水500 mL浸泡药物30 min,武火煎沸后改文火煎,保留药渣,提取药液,再加水300 mL煎煮,取2次药液混合,浓缩YYHYJDD生药2.88 g/mL,用标示好的消毒棕色玻璃瓶保存于4℃冰箱备用。

含药血清制备:无特定病原(specific pathogenfree,SPF)雄性 SD大鼠 70只,体重(180±20)g,随机分为空白血清组40只,YYHYJDD组30只。YYHYJDD给药组相当于60 kg成人144 g/d的等效剂量,按人体表面积折算即14.4 g/kg进行药物灌胃,空白血清对照组给予同等量的生理盐水,每天称重调整灌胃剂量,连续给药7 d,随后禁食1夜,不禁水。配置10%的水合氯醛,按动物体重4 mL/kg进行腹腔麻醉,腹主动脉取血,全血在4℃冰箱静置2 h后3 000 r/min离心15 min,取上清,56℃热灭活过滤,最后置于-20℃冷冻备用。

1.2 实验动物

SPF级雄性SD大鼠购于长沙斯莱克景达实验动物有限公司,动物合格证号:SCXK(湘)2016-0002,在江西中医药大学中医基础理论分化发展研究中心动物房饲养:常温25℃左右；湿度控制在60%左右；每天定时换水、换垫料；两天换框1次,适应性喂养7 d后灌胃。

1.3 试剂和仪器

CellTiter 96®AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒(简称MTS,美国Promega公司,货号:G3580)；AOEB双染试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,货号:CA1140)；Annexin V-FITC/PI双染试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司,货号:AP01)；RPMI1640培养基(美国Hyclone公司,货号:SH30809)；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司,货号:GP3108)；磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS,北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司,货号:BF-0011)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司,货号:1101-18611)；accutase酶(杭州联科生物技术股份有限公司,货号:AT001)；BCA总蛋白质测定试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司,货号:BCA02)；一抗anti-Bcl-2(美国Abcam公司,货号:ab32124)；一抗anti-Bax(美国Abcam公司,货号:ab32503)；二抗goat anti-rabbit IgG(北京康为世纪生物科技有限公司,货号:CW103S)。

细胞培养箱(Forma 3111,美国Thermo Fisher公司)；多功能酶标仪(Spark 10M,瑞士Tecan公司)；流式细胞仪(Moflo XDP,美国Beckman Coulter公司)；倒置荧光显微镜系统(IX71,日本Olympus公司)；大型旋转蒸发仪(R-220SE,瑞士步琪公司)；水平电泳仪(Powerpac,美国Bio-Rad公司)；化学发光凝胶成像系统(Chemi Doc XRS+,美国Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养

人结肠癌HCT116细胞购于中国科学院细胞库。常规复苏HCT116细胞后将其培养在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中,置于37℃、5%CO2的培养箱内培养并传代,待HCT116细胞生长至对数生长期时进行干预实验。

1.4.2 实验分组

实验分为5组。正常组:结肠癌细胞中加入20%PBS和80%胎牛血清培养基(培养基中均含有10%的胎牛血清)；空白血清对照组:结肠癌细胞中加入20%空白血清(大鼠给予生理盐水灌胃取血获得)和80%胎牛血清培养基；YYHYJDD含药血清组:低、中、高剂量组的结肠癌细胞中分别加入5%、10%、20%的含药血清,同时分别加入比例为15%、10%和0%的空白血清,胎牛血清培养基的量均为80%。

1.4.3 细胞活性检测

每个时间点每组细胞设6个平行孔,置于培养箱分别培养24 h、48 h、72 h和 96 h后加入MTS溶液20 μL,继续培养4 h,随后取出培养板并在多功能酶标仪490 nm处测定各孔OD值。细胞抑制率=(空白血清对照组平均OD值-给药组平均OD值)/空白血清对照组平均OD值。

1.4.4 细胞AOEB染色及形态观察

平铺在6孔板中的细胞用含药血清处理72 h后易脱落,为了避免后续实验出现假阳性结果,依据1.4.3细胞增殖活性检测结果,我们统一选择含药血清干预48 h的细胞开展AOEB染色和流式细胞术分析。将对数生长期的细胞按每孔5×103个接种于96孔板中,细胞贴壁之后进行分组处理,5组细胞中每个孔的液体量均为200 μL,每组3个复孔。干预结肠癌HCT116细胞48 h后,弃掉上清液,用PBS清洗,轻柔倒去漂浮的细胞和PBS,每孔再加入PBS 100 μL和1︰1比例配制的AOEB染液3 μL,避光染色5 min,用PBS洗1遍弃掉荧光染液,在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况并拍照记录。

1.4.5 细胞Annexin V-FITC/PI染色及流式细胞术检测

各组细胞均按5×105个/孔接种3个复孔,放入培养箱培养48 h,随后取出。用accutase酶消化细胞,1 000 r/min离心3 min,PBS清洗3次,弃掉上清,加入预冷的1×binding buffer重悬,再加入异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)5 μL 和碘化丙啶(propidium iodide,PI)10 μL,避光染色15 min。细胞过滤后在流式细胞仪上检测,实验结果用Flow jo 7.6.1软件分析。在Annexin V-FITC/PI结果中,左下象限为活细胞群；右下象限为早期凋亡细胞；右上象限为晚期凋亡细胞；左上象限为坏死细胞和机械损伤细胞。

1.4.6 免疫印迹分析

各组细胞干预培养48 h后进行总蛋白质提取。根据标准品蛋白质的吸光度值,绘制出标准曲线,将每组总蛋白质吸光度值代入标准曲线中计算每组总蛋白质浓度。配制蛋白质样品并在沸水中煮5 min进行样品变性,随后进行免疫印迹实验。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中,上样量为25 μg,电泳参数为80 V、120 min。电泳结束后在270 mA条件下转膜50 min,洗膜3次,5%脱脂牛奶封闭50 min；在4℃冰箱摇床上一抗(anti-Bax、anti-Bcl-2的稀释比例均为1︰1 000)孵育过夜,洗膜液洗膜3次后常温孵育二抗(稀释比例均为1︰5 000)1 h,再次洗膜3次后ECL显影,用Image Lab软件分析蛋白质相对表达量的灰度值。

1.4.7 数据处理

采用GraphPad Prism 7.0软件分析数据。实验数据以平均值±标准差±s)表示,组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 YYHYJDD含药血清抑制结肠癌HCT116细胞活性

为了探究YYHYJDD含药血清对结肠癌细胞的影响,在HCT116细胞中加入低、中、高剂量的含药血清干预培养24 h、48 h、72 h和96 h,测定各组细胞在490 nm处的OD值。从表1结果可知,与空白血清对照组比较,含药血清处理24 h对细胞增殖无显著影响(P＞0.05),但处理48 h、72 h和96 h时细胞增殖明显出现抑制,其中48 h和72 h 的效果显著(P＜0.01)。

2.2 YYHYJDD含药血清影响结肠癌HCT116细胞的形态

在荧光显微镜下,我们观察到4种细胞形态:1)活细胞,呈现正常的梭形,核染色质为绿色均匀状；2)早期凋亡细胞,核染色质出现绿色的固缩状,荧光变深变亮,梭形细胞变圆；3)晚期凋亡细胞,核染色质出现橘色的固缩状；4)坏死细胞,核染色质出现橘色,细胞膨大变形。从图1结果可知,正常组和空白血清对照组中的细胞绝大多数为着色均匀并呈绿色的活细胞；对于YYHYJDD含药血清组而言,低剂量组的坏死细胞开始增多,中剂量组的早期凋亡细胞增多,高剂量组的坏死细胞最多。

2.3 YYHYJDD含药血清对结肠癌HCT116细胞凋亡的影响

从图2的Annexin V-FITC/PI双染结果可知,与空白血清对照组相比,YYHYJDD含药血清低、中、高剂量组均有促细胞凋亡的作用(P＜0.05或P＜0.01),且中剂量组效果最显著,总凋亡率为10.22%～22.60%(P＜0.01),说明YYHYJDD含药血清能促进结肠癌细胞发生凋亡。

表1 YYHYJDD含药血清对HCT116细胞活性的影响Table 1 Effects of YYHYJDD-containing serum on the activity of HCT116 cells

图1 YYHYJDD含药血清对HCT116细胞形态的影响A:正常活细胞；B:早期凋亡细胞；C:晚期凋亡细胞；D:坏死细胞。标尺:20 μm。Fig.1 Effects of YYHYJDD-containing serum on morphology of HCT116 cellsA:Normal living cells；B:Early apoptotic cells；C:Late apoptotic cells；D:Necrotic cells.Scale bar:20 μm.

2.4 YYHYJDD含药血清对Bcl-2和Bax表达的影响

各组细胞中目标蛋白质的表达结果如图3所示。与空白血清对照组比较,Bax的表达在5%低剂量含药血清组中无显著差异(P＞0.05),但在10%、20%的含药血清组中明显升高(P＜0.01)；Bcl-2在20%的高剂量含药血清组中的表达显著下调(P＜0.05)；Bcl-2/Bax 的比值在 10%(P＜0.05)、20%(P＜0.01)含药血清组中下调显著,说明YYHYJDD含药血清能促进HCT116细胞Bax蛋白的表达,同时抑制Bcl-2蛋白的表达。

图2 YYHYJDD含药血清对HCT116细胞凋亡的影响Fig.2 Effects of YYHYJDD containing serum on apoptosis of HCT116 cells

图3 YYHYJDD含药血清对HCT116细胞凋亡相关蛋白质表达的影响Fig.3 Effects of YYHYJDD-containing serum on expressions of apoptosis-related proteins in HCT116 cells

3 讨论

恶性程度高、发展速度快、预后差及放化疗耐药性的出现往往导致结肠癌的治疗效果不明显[7]。中医药以其独特的理论和疗效在防治结肠癌过程中发挥着积极的作用[8]。前期的整体动物实验证明,YYHYJDD可以抑制病变细胞核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)蛋白表达,逆转小鼠结肠癌癌前病变腺窝区和上皮内瘤变[9]。我们的实验结果表明,YYHYJDD含药血清促进了结肠癌细胞凋亡(图1,图2),这可能是其临床治疗结肠癌有效的重要原因。

免疫印迹结果显示,YYHYJDD使结肠癌细胞中Bcl-2蛋白的表达下调,Bax蛋白的表达上调,同时Bcl-2与Bax的比值下调(图3),这可能是其促进结肠癌细胞凋亡的作用机制。Bcl-2可维持线粒体膜的稳定性和通透性,减少细胞色素C的释放,并发挥抗凋亡的作用[10]。而Bax是Bcl-2家族蛋白中的促凋亡蛋白和凋亡调节有关的同源物,在肿瘤的发展中表达异常,其能与Bcl-2形成异二聚体,从而抵消Bcl-2的作用,Bcl-2/Bax的比值决定了细胞的凋亡程度[11]。通过Bcl-2与Bax这条途径,多种中药具有促进结肠癌细胞凋亡的作用,比如:中药重楼单体PP-22可促进结肠癌SW620细胞凋亡[12]；红花多糖可提高结肠癌LoVo细胞凋亡率[13]。另外,雷公藤甲素[14]和莪术醇[15]也可以通过下调Bcl-2蛋白、上调Bax蛋白的表达促进结肠癌HCT116细胞凋亡。这都与我们的实验结果相一致。虽然Bcl-2与Bax在肿瘤细胞凋亡中具有重要的调控作用,但其蛋白质表达程度并非是肿瘤细胞凋亡的唯一因素,因此YYHYJDD对Bcl-2与Bax翻译后修饰的影响,以及它们与caspase家族、死亡受体和配体等的关系有待进一步研究。