小分子化合物WK429抑制炎症和降低体液免疫反应的研究

胡 盼,邢雅婧,彭世鸿,谢玖清,郭伟凯,谢佳伊,刘明耀,易正芳

(华东师范大学生命科学学院上海市调控生物学重点实验室生命医学研究所,中国上海200241)

在周围淋巴器官(如脾脏、扁桃体、淋巴结)中,成熟的B细胞在经过T细胞依赖性抗原刺激后,可依附于滤泡树突状细胞(follicular dendritic cell,FDC)组成网状组织,形成一个短暂的动态组织结构,称为生发中心(germinal center,GC)[1～2]。成熟的GC含有多种类型的免疫细胞,包括滤泡辅助性T细胞(T follicular helper cell,Tfh cell)、生发中心 B细胞(germinal center B cell,GC B cell)、滤泡树突状细胞和巨噬细胞等[3]。

GC反应是一种T细胞依赖性抗原的免疫应答过程,这个过程包括活化的B细胞经历克隆增殖、体细胞高频突变、抗体类别转换以及分化为产生高亲和力抗体的浆细胞或记忆B细胞[4]。GC反应是体液免疫的基础,是机体发挥获得性免疫的重要组成部分。B细胞淋巴瘤6(B cell lymphoma 6,BCL6)是GC 形成和维持的重要调节因子[5～6]。在不同的免疫细胞类型中,BCL6具有其独特的功能。BCL6对于Tfh细胞和GC B细胞的发育与功能至关重要[5]。BCL6已成为Tfh细胞的主要转录因子之一,影响Tfh细胞的分化及其特征分子的表达[7～8]。在抗体类别转换过程中,BCL6允许GC B细胞进行体细胞高频突变和DNA双链的断裂,并通过抑制DNA损伤反应和检查点基因来更好地应对这种压力[9]。

BCL6是一种转录抑制因子,属于BTB/POZ/锌指核酶家族成员,由706个氨基酸残基组成。根据结构和功能,BCL6包括3个结构域:N端的BTB/POZ结构域(1～130号氨基酸残基)、预测具有很少或没有固定结构的中心区域(131～517号氨基酸残基)和C端的6个锌指结构域(518～681号氨基酸残基)[9]。BCL6功能的发挥需要BTB二聚化形成同源二聚体,二聚化的BTB招募转录共抑制子SMRT(silencing mediator of retinoid and thyroid receptors)、N-CoR(nuclear receptor corepressor)和BCoR(BCL6 interacting corepressor),抑制靶基因的表达[9～11]。研究表明,在小鼠中敲除BCL6,小鼠不能形成GC,也不能产生高亲和力抗体,而且BCL6基因全身性敲除小鼠会出现致死性炎症疾病[6,12～13]。后续研究表明,在小鼠体内突变BTB结构域的两个氨基酸(N21K,H116A)可以破坏其招募转录共抑制子的功能,使BCL6不能发挥转录抑制作用,同时小鼠体内的GC和分泌的高亲和力抗体明显减少,但是小鼠没有出现炎症和不良反应[14]。现有研究报道,GC和自身抗体存在于多种自身免疫性疾病患者体内或者动物模型中,比如:系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)[15～17]。目前,系统性红斑狼疮的靶向药物极其缺乏,50多年来,美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)仅批准了贝利单抗(belimumab)用于系统性红斑狼疮的治疗[18]。由于BCL6和GC的形成与高亲力抗体的产生密切相关,已有研究者初步尝试将靶向BCL6BTB结构域的多肽类抑制剂BPI-1用于治疗系统性红斑狼疮。虽然只是个例治疗,但是患者出现了积极的应答反应[19],这提示靶向BCL6BTB结构域的药物具有治疗系统性红斑狼疮的潜力。因此,本文以BCL6为靶点,开发针对BCL6BTB结构域的新型高效小分子抑制剂,系统性地评价BCL6小分子抑制剂对Tfh细胞、GC B细胞和浆细胞的影响,以及炎症因子的分泌和抗体的生成,希望为体液免疫反应过强的自身免疫性疾病的预防或治疗提供新策略。

1 材料与方法

1.1 材料

8～10周龄雄性C57BL/6小鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。小鼠腹腔巨噬细胞Raw264.7和人弥漫大B细胞株SUDHL4购于美国ATCC。分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)所用的血液来自志愿者的静脉血,由上海长海医院提供,符合人体伦理标准。小分子化合物来源于华东师范大学生命科学学院陈益华教授课题组。

均相时间分辨荧光(homogeneous time-resolved fluorescence,HTRF)稀释缓冲液、6His-XL665 和GST-Tb购于Cisbio公司(美国)；BCL6蛋白和SMRT多肽购于北京安必奇生物科技有限公司；DMEM培养基、1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和青霉素&链霉素(penicillin & streptomycin,P/S)双抗均购自Gibco公司(美国)；羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimide ester,CFSE)、FITC-Annexin V 凋亡检测试剂盒、donkey anti-rat IgG(H+L)-Alexa Fluor 488、eFluor 660-anti-GL7 和IgG(total)酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购于ThermoFisher Scientific公司(美国)；4-羟基-3-硝基苯基乙酰基(4-hydroxy-3-nitrophenylacetyl,NP)购自 Santa Cruz公司(美国)；鸡免疫球蛋白(chicken gamma globulin,CGG)购于Cedarlane公司(加拿大)；白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)和白细胞介素-21(interleukin-21,IL-21)购于PeproTech公司(美国)；anti-CD16/32 Fc购于 eBioscience公司(美国)；白细胞介素-17A(interleukin-17A,IL-17A)、γ 干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和 IL-6 ELISA 试剂盒以及PerCP/cy5.5-anti-B220、PerCP/cy5.5-anti-CD4、PE-anti-CXCR5、streptavidin-Cy3、PE-anti-IgG1和APC-anti-PD-1购于BioLegend公司(美国)；FITC-anti-FAS、FITC rat anti-mouse CD38、APC rat anti-mouse CD138、IgD、purified NA/LE hamster anti-mouse CD28、purified NA/LE hamster anti-mouse CD3e、红细胞裂解液和 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)显色液购于BD Pharmingen公司(美国)；冰冻切片包埋剂(opti-mum cutting temperature compound,OCT)购于Sakura公司(美国)；脂多糖、防淬灭剂、刀豆蛋白A和花生凝集素(peanut agglutinin,PNA)购于Sigma公司(德国)；3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,MTS)]购于Promega公司(美国)；造血细胞无血清X-VIVO培养基购于Lonza公司(瑞士)；羧甲基纤维素钠购于上海阿拉丁试剂有限公司；淋巴细胞分离液购于天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。

1.2 小分子化合物的筛选

HTRF是一种可以用于检测纯液相体系中两种蛋白质相互作用的技术,其结合了荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)和时间分辨荧光(time-resolved fluorescence,TRF)两种技术,具有更高的灵敏度和稳定性。在本研究的筛选体系中,能量供体为GST-Tb和BCL6BTBGST,受体为6His-SMRT和6His-XL665,当BCL6BTB与SMRT结合时,BCL6BTB供体上的荧光能量会转移到 SMRT受体上,此时在665 nm处能检测到荧光,如果药物破坏了二者的结合,则荧光消失或减弱。实验体系为20 μL,在384孔板中加入5× BCL6BTB-GST(6.25 nmol/L)和 5× 6His-SMRT(200 nmol/L),体积均为4 μL,室温孵育0.5 h,每组设两个复孔,然后加入10×不同浓度WK429小分子化合物(2 μL),再加入GST-Tb和6His-XL665,体积均为5 μL,室温孵育过夜,在Cytation 5细胞成像微孔板检测仪上读出每孔的数值。

1.3 细胞增殖实验

1.3.1 外周血单个核细胞的分离

在50 mL离心管中加入15 mL淋巴细胞分离液,将血液轻轻吹打混匀,缓慢加入2倍体积的血液于淋巴细胞分离液面上,保持界面清晰。800 r/min离心25 min后,液面分为三层,弃去上层,吸取中间层至新的50 mL离心管中,加入1×磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)(pH=7.4),轻轻吹打均匀,500 r/min离心10 min后弃上清,1×PBS重悬细胞并计数。

1.3.2 细胞的培养

人弥漫大B细胞株SUDHL4培养于含10%胎牛血清的1640培养基中,小鼠巨噬细胞Raw264.7培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,PBMC培养于含有IL-2(200 U/mL)的X-VIVO培养基中,P/S的浓度为1%。细胞培养在37℃恒温培养箱中,湿度为95%,CO2体积浓度为5%。

1.3.3 MTS法测定细胞增殖

铺细胞于96孔板中,细胞密度为2.5×103～10×103,每孔 100 μL。过夜培养后,加入 WK429(给药组)或 FX1(阳性组),药物浓度为:0.045 μmol/L、0.137μmol/L、0.411μmol/L、1.234μmol/L、3.703μmol/L、11.110 μmol/L、33.330 μmol/L 和 100 μmol/L。对照组加入等量的完全培养基,每组设两个复孔。药物孵育72 h后,每孔加入20 μL MTS,在490 nm波长下用酶标仪测定OD值,统计并分析药物对细胞活力的影响。

1.4 细胞凋亡实验

取生长状态良好的PBMC,调整细胞密度为1.0×106～2.0×106cells/mL,接种于 6 孔板,进行药物处理。将细胞分为对照组、给药组和阳性组,其中,对照组加入完全培养基；给药组加入完全培养基和不同浓度的 WK429(5 μmol/L 或 10 μmol/L)；阳性组加入完全培养基和不同浓度的阳性药物FX1(5 μmol/L 或 10 μmol/L)。处理 48 h,随后收集细胞于离心管中,800 r/min离心5 min,弃上清,1× PBS 洗涤一次,1× binding buffer(100 μL)重悬细胞。细胞分为不染组(不加染色试剂)、单染碘化丙啶(propidium iodide,PI)组(加入 5 μL PI)、单染Annexin V 组(加入 5 μL Annexin V)以及 PI和 Annexin V双染组(PI和Annexin V各加入5 μL)。不同染色组细胞混匀后,室温避光孵育15 min,再加入1×binding buffer(300 μL),用流式细胞仪BD LSRFortessa进行检测。

1.5 脂多糖和刀豆蛋白A刺激PBMC分泌炎症因子实验

取生长状态良好的PBMC,调整细胞密度为1.0×106～2.0×106cells/mL,接种于 12 孔板,进行药物处理。将细胞分为空白组、对照组、给药组和阳性组,其中,空白组加入完全培养基；对照组加入完全培养基和脂多糖(10 μg/mL)；给药组加入完全培养基、脂多糖(10 μg/mL)和不同浓度的WK429(5 μmol/L 或 10 μmol/L)；阳性组加入完全培养基、脂多糖(10 μg/mL)和不同浓度的阳性药物FX1(5 μmol/L 或 10 μmol/L)。培养 24 h 后收集细胞于离心管中,1 000 r/min离心5 min,收集上清,采用ELISA试剂盒检测细胞上清中的炎症因子IL-6和TNF-α。刀豆蛋白A刺激PBMC分泌炎症因子实验的操作步骤如上所述,刀豆蛋白A的质量浓度为5 μg/mL,采用ELISA试剂盒检测细胞上清中的炎症因子IFN-γ和IL-17A。

1.6 脂多糖刺激Raw264.7细胞分泌炎症因子和趋化因子实验

取生长状态良好的Raw264.7细胞,调整细胞密度为 0.5×106～1.0×106cells/mL,接种于 12 孔板,12 h后进行药物处理。如方法1.5所述,将细胞分为空白组、对照组、给药组和阳性组,脂多糖添加水平为100 ng/mL。培养48 h后收集细胞,提取RNA并将其反转录成cDNA,采用荧光定量PCR 检测炎症因子 IL-1β、IL-6、IL-12p40、TNF-α、CCL2和CCL7的表达。PCR检测的引物信息如下:IL-1β-F:5′-CACAGAGGATACCACTCCCAACA-3′,IL-1β-R:5′-TCCACGATTTCCCAGAGAACA-3′；IL-6-F:5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3′,IL-6-R:5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3′；IL-12p40-F:5′-TGGTTTGCCATCGTTTTGCTG-3′,IL-12p40-R:5′-ACAGGTGAGGTTCACTGTTTCT-3′；TNF-α-F:5′-CCTGTAGCCCACGTCGTAG-3′,TNF-α-R:5′-GGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3′；CCL2和 CCL7基因的引物序列参照文献[14]。

1.7 体外Tfh细胞形成实验

1.7.1 脾脏细胞的分离

麻醉处死8～10周龄C57BL/6小鼠,经75%乙醇消毒后,取出小鼠脾脏并将其置于40 μm的滤网上。用注射器内芯充分研磨脾脏,然后用1×MACS缓冲液(1×PBS+2%FBS+2 mmol/L EDTA)冲洗并收集细胞悬液。1 500 r/min离心5 min,弃去上清,加入1×红细胞裂解液,裂解2 min左右,随后加入5倍体积的缓冲液终止裂解,用40 μm的滤网过滤去除细胞团块；将过滤液1 500 r/min离心5 min,弃去上清,再用1×MACS缓冲液重悬细胞,并进行计数。

1.7.2 Tfh细胞形成实验

分选出初始CD4+T细胞,调整细胞密度为2.0×105～4.0×105cells/mL,铺 24 孔板,进行药物处理。将细胞分为对照组、给药组和阳性组,其中,对照组只加入刺激因子:anti-CD3(5 μg/mL)、anti-CD28(2 μg/mL)、anti-IFN-γ (10 μg/mL)、anti-IL-4(10 μg/mL)、anti-TGF-β (20 μg/mL)、IL-6(100 ng/mL)和IL-21(50 ng/mL)；给药组加入刺激因子和不同浓度的 WK429(5 μmol/L 或 10 μmol/L)；阳性组加入刺激因子和不同浓度的阳性药物FX1(5 μmol/L或10 μmol/L)。培养72 h后收集细胞进行染色,用流式细胞仪BD LSRFortessa检测Tfh细胞(CD4+CXCR5+PD-1+)的形成。

1.8 体外GC B细胞形成实验

从脾脏中分离出单个细胞,然后分选出总B(B220+)细胞,调整细胞密度为 3.0×105～5.0×105cells/mL,铺24孔板,进行药物处理。如方法1.5所述,将细胞分为空白组、对照组、给药组和阳性组。培养72 h后收集细胞进行染色,用流式细胞仪BD LSRFortessa检测GC B细胞(B220+GL7+)的形成。

1.9 体外浆细胞的分裂和形成实验

将分选出的总B(B220+)细胞用1×PBS溶液洗涤两次以除去多余的血清,800 r/min离心5 min,弃去上清,用1×PBS(室温)重悬细胞,调整细胞密度为 5.0×106～10×106cells/mL,加入 CFSE 染料至终浓度为2 μmol/L,随后立即混匀细胞悬液,室温避光孵育10 min。加入4～5倍预冷的完全培养基,冰上孵育5 min,随后800 r/min离心5 min,弃去上清,重悬细胞,调整细胞密度为3.0×105～5.0×105cells/mL,铺24孔板,进行药物处理。将细胞分为空白组、对照组、给药组和阳性组,其中,空白组加入完全培养基；对照组加入完全培养基、脂多糖(10 μg/mL)和 IL-4(10 ng/mL)；给药组加入完全培养基、脂多糖(10 μg/mL)、IL-4(10 ng/mL)和不同浓度的 WK429(5 μmol/L 或 10 μmol/L)；阳性组加入完全培养基、脂多糖(10 μg/mL)、IL-4(10 ng/mL)和不同浓度的阳性药物FX1(5 μmol/L或10 μmol/L)。培养72 h后收集细胞进行染色,用流式细胞仪BD LSRFortessa检测浆细胞的分裂(CFSE)和浆细胞(B220-CD138+)的比例。

1.10 体内生发中心形成实验

1.10.1 动物免疫实验

选择8～10周的C57BL/6小鼠,腹腔注射100 μg NP偶联的CGG。免疫2 d后随机分为3组,其中,对照组为溶剂羧甲基纤维素钠,给药组为WK429(50 mg/kg),阳性组为FX1(50 mg/kg)。给药频率为每天1次,给药组给药方式为灌胃给药,阳性组给药方式为腹腔注射给药。连续给药12 d,免疫后第14天麻醉处死小鼠,取小鼠脾脏放置于1×PBS中。

1.10.2 脾脏细胞的免疫荧光实验

用OCT包埋脾脏,放入液氮冷冻后置于-80℃保存。在冰冻切片机上将脾脏切成6 μm的薄片,丙酮固定15 min后室温晾干；PBS洗涤10 min,再用0.1%的Triton-X 100通透10 min,10%的FBS封闭30 min；4℃孵育一抗(PNA+IgD)过夜,PNA的稀释比例为1︰200,IgD的稀释比例为1︰500,再用PBST洗3遍,每次3 min,随后常温孵育二抗[streptavidin-Cy3+donkey anti-rat IgG(H+L)-Alexa Fluor 488],streptavidin-Cy3的稀释比例为1︰100,donkey anti-rat IgG(H+L)-Alexa Fluor 488的稀释比例为1︰300,1 h后回收二抗并同样用PBST洗3遍,每次3 min；加入防淬灭剂,盖上盖玻片,封片后将其置于荧光显微镜下观察并拍照。

1.10.3 流式细胞术分析实验

从小鼠脾脏中分离出单个细胞,调整细胞密度为1×106cells/mL。每个样本取50 μL重悬的细胞,封闭后分别加入50 μL稀释好的流式抗体(比例为1︰100),用于GC染色的抗体:PerCP/cy5.5-anti-B220、FITC-anti-FAS 和 eFluor 660-anti-GL7；用于Tfh细胞检测的抗体:PerCP/cy5.5-anti-CD4、PE-anti-CXCR5和APC-anti-PD-1；用于记忆B细胞检测的抗体:FITC rat anti-mouse CD38和PE-anti-IgG1；用于浆细胞检测的抗体:PerCP/cy5.5-anti-B220和APC rat anti-Mouse CD138,4℃避光孵育30 min。加入1 mL的缓冲液终止染色,1 500 r/min离心 5 min,弃去上清,用 300～400 μL缓冲液重悬细胞,并转移到流式管中,用流式细胞仪BD LSRFortessa检测Tfh细胞(CXCR5+PD-1+)、GC B 细胞(FAS+GL7+)、记忆 B 细胞(CD38+IgG1+)和浆细胞(B220-CD138+)的变化。

1.11 血清中抗体IgG的检测

实验结束时,小鼠眼眶取血,室温静置1 h,6 000 r/min离心10 min,吸上层液体(血清)至新的离心管中,按照说明书采用小鼠IgG(total)ELISA试剂盒检测血清中抗体IgG的含量。

1.12 统计学处理

数据用GraphPad Prism 5软件进行统计和分析,多组间比较采用单因素方差分析,P值表示差异的显著性,当P＞0.05时,差异不显著,标注为ns；在差异显著的情况下,P＜0.05标注为*,P＜0.01标注为**,P＜0.001标注为***。

2 结果

2.1 小分子化合物WK429的筛选和细胞活性评价

为了检测目标小分子化合物是否可阻断BCL6BTB与SMRT的结合,本文构建了HTRF药物筛选体系,从小分子化合物库中筛选到活性最好的化合物WK429(图1)。对于BCL6高表达的人弥漫大B细胞株SUDHL4,WK429明显抑制其生长；此外,WK429对小鼠腹腔巨噬细胞Raw264.7和 PBMC 的 IC50＞100 μmol/L,表明 WK429 对免疫细胞没有毒性作用(表1)。

图1 WK429的化学结构Fig.1 The chemical structure of WK429

2.2 WK429对PBMC的凋亡没有影响

采用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,实验结果显示,与对照组(即 Control组)相比,10 μmol/L WK429给药组的细胞凋亡比例基本没有变化(P＞0.05)(图2)。这表明WK429不影响PBMC的凋亡。

2.3 WK429抑制PBMC分泌炎症因子

在PBMC的炎症因子分泌实验中,与空白组(即Blank组)相比,脂多糖(Control组)刺激明显促进PBMC分泌炎症因子IL-6(P＜0.001)和TNF-α(P＜0.01)；而与 Control组相比,10 μmol/L WK429处理后,炎症因子 IL-6(P＜0.01)和 TNF-α (P＜0.05)的产生明显降低(图3A)。此外,在刀豆蛋白A刺激PBMC实验中,与Blank组相比,刀豆蛋白A(Control组)刺激明显促进PBMC分泌炎症因子IFN-γ(P＜0.001)和 IL-17A(P＜0.001)；而与 Control组相比,10 μmol/L WK429处理后,炎症因子 IFN-γ(P＜0.001)和 IL-17A(P＜0.001)的产生也明显降低(图3B)。实验结果表明在脂多糖或者刀豆蛋白A的刺激下,WK429抑制PBMC分泌炎症因子。

表1 WK429的活性评价Table 1 The activity evaluation of WK429

图2 WK429对PBMC凋亡的影响(A)PBMC细胞凋亡的流式图；(B)PBMC细胞凋亡的统计图。ns:P＞0.05 vs.对照组。Fig.2 Effect of WK429 on the apoptosis of PBMCs(A)The apoptotic cells of PBMC were analyzed by flow cytometry；(B)The apoptotic cells of PBMC were calculated.ns:P＞0.05,compared with the control group.

2.4 WK429抑制Raw264.7细胞分泌炎症因子和趋化因子

在Raw264.7细胞的炎症因子分泌实验中,与空白组(即 Blank组)相比,脂多糖(Control组)刺激明显促进Raw264.7细胞分泌炎症因子IL-1β(P＜0.001)、IL-6(P＜0.001)、IL-12p40(P＜0.001)和TNF-α (P＜0.001)；而与 Control组相比,10 μmol/L WK429 处理后,炎症因子 IL-1β (P＜0.001)、IL-6(P＜0.001)、IL-12p40(P＜0.01)和 TNF-α (P＜0.01)的产生明显降低(图4A)。此外,与Blank组相比,脂多糖(Control组)刺激明显促进Raw264.7细胞分泌趋化因子 CCL2(P＜0.001)和 CCL7(P＜0.001)；而与Control组相比,10 μmol/L WK429处理后,趋化因子 CCL2(P＜0.001)和 CCL7(P＜0.001)的表达也明显下调(图4B)。实验结果表明在脂多糖的刺激下,WK429抑制Raw264.7细胞分泌炎症因子和趋化因子。

图3 WK429抑制PBMC分泌炎症因子(A)在脂多糖刺激下,WK429抑制PBMC分泌炎症因子IL-6和TNF-α；(B)在刀豆蛋白A刺激下,WK429抑制PBMC分泌炎症因子 IFN-γ和 IL-17A。ns:P＞0.05；*:P＜0.05；**:P＜0.01；***:P＜0.001。Fig.3 WK429 inhibited the production of inflammatory factors in PBMCs(A)WK429 inhibited the expression of inflammatory factors IL-6 and TNF-α in PBMCs stimulated by lipopolysaccharide；(B)WK429 inhibited the expression of inflammatory factors IFN-γ and IL-17A in PBMCs stimulated by concanavalin A.ns:P＞0.05；*:P＜0.05；**:P＜0.01；***:P＜0.001.

2.5 WK429体外抑制Tfh细胞的形成

在刺激因子的作用下,对照组(即Control组)中的初始CD4+T细胞明显分化成Tfh细胞,而与Control组相比,10 μmol/L WK429给药组中Tfh细胞(CXCR5+PD-1+)的比例明显降低(P＜0.001),并且低于10 μmol/L FX1阳性组Tfh细胞的比例(图5)。实验结果表明WK429体外抑制Tfh细胞的形成。

2.6 WK429体外抑制GC B细胞的形成

采用流式细胞术检测体外培养条件下GC B细胞的形成情况,实验结果显示,与空白组(即Blank组)相比,脂多糖(Control组)处理下GC B细胞(B220+GL7+)的比例明显增加(P＜0.001),而与Control组相比,10 μmol/L WK429给药组中GC B细胞的比例明显降低(P＜0.001),并且低于10 μmol/L FX1阳性组GC B细胞的比例(图6)。实验结果表明WK429体外抑制GC B细胞的形成。

2.7 WK429体外抑制浆细胞的分裂和形成

采用流式细胞术检测体外培养条件下浆细胞的分裂和形成,实验结果显示,与空白组(即Blank组)相比,脂多糖(Control组)处理下峰形图左移且峰的数目明显增加(P＜0.01),这表示浆细胞的分裂能力增强；而与Control组相比,10 μmol/L WK429给药组中峰形图右移并且峰的数目显著减少(P＜0.01),几乎是单一峰形,基本恢复到Blank组的水平,这表示浆细胞的分裂能力显著降低(图7A,C)。此外,与Blank组相比,Control组中浆细胞(B220-CD138+)的比例明显增加(P＜0.001),而与Control组相比,10 μmol/L WK429给药组中浆细胞的比例明显降低(P＜0.001),并且低于10 μmol/L FX1阳性组浆细胞的比例(图7B,D)。实验结果表明WK429体外抑制浆细胞的分裂和形成。

2.8 WK429体内抑制Tfh细胞和GC B细胞的形成

动物免疫后第14天,GC形成达到高峰,取小鼠脾脏检测Tfh细胞和GC B细胞的形成情况。流式细胞术分析结果表明,与单纯的羧甲基纤维素钠(Control组)处理相比,50 mg/kg WK429给药组脾脏中Tfh细胞(CXCR5+PD-1+)的比例明显降低(P＜0.01),并且显著低于50 mg/kg FX1阳性组的比例(P＜0.05)(图 8A,C)；此外,与 Control组相比,50 mg/kg WK429给药组脾脏中GC B细胞(FAS+GL7+)的比例也明显降低(P＜0.01),并与50 mg/kg FX1阳性组的比例相当(图8B,D)；但是,与50 mg/kg WK429给药组相比,50 mg/kg FX1阳性组脾脏中总B细胞的比例显著降低(P＜0.05)(图8E)。因此,WK429可抑制脾脏中Tfh细胞和GC B细胞的形成。

2.9 WK429体内抑制生发中心的形成

动物免疫后第14天,取小鼠脾脏进行免疫荧光实验以检测GC的形成。PNA是GC特异表达的糖蛋白,可以用于GC染色,IgD可用于总B细胞染色。与流式细胞术结果一致,免疫荧光结果表明,与Control组相比,50 mg/kg WK429给药组脾脏中GC的面积(图9A黄色箭头所指)明显减少(P＜0.001),并且低于50 mg/kg FX1阳性组脾脏中GC的面积(图9)。因此,免疫荧光实验结果同样证明WK429可体内抑制GC的形成。

图4 在脂多糖刺激下WK429抑制Raw264.7细胞分泌炎症因子和趋化因子(A)在Raw264.7细胞中,WK429抑制炎症因子IL-1β、IL-6、IL-12p40和TNF-α的表达；(B)在Raw264.7细胞中,WK429抑制趋化因子 CCL2 和 CCL7 的表达。ns:P＞0.05；*:P＜0.05；**:P＜0.01；***:P＜0.001。Fig.4 WK429 inhibited inflammatory factor and chemokine secretion in Raw264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide(A)WK429 inhibited the expression of inflammatory factors IL-1β,IL-6,IL-12p40 and TNF-α in Raw264.7 cells；(B)WK429 inhibited the expression of chemokines CCL2 and CCL7 in Raw264.7 cells.ns:P＞0.05；*:P＜0.05；**:P＜0.01；***:P＜0.001.

2.10 WK429体内抑制浆细胞的形成和抗体IgG的产生

图5 WK429体外抑制Tfh细胞的形成(A)WK429抑制Tfh细胞形成的流式图；(B)WK429抑制Tfh细胞形成的统计图。ns:P＞0.05 vs.对照组；*:P＜0.05 vs.对照组；**:P＜0.01 vs.对照组；***:P＜0.001 vs.对照组。Fig.5 WK429 inhibited the formation of Tfh cells in vitro(A)The rate of CXCR5+PD-1+Tfh cells was analyzed by flow cytometry；(B)The rate of Tfh cells was calculated.ns:P＞0.05,compared with the control group；*:P＜0.05,compared with the control group；**:P＜0.01,compared with the control group；***:P＜0.001,compared with the control group.

图6 WK429体外抑制GC B细胞的形成(A)WK429抑制GC B细胞形成的流式图；(B)WK429抑制GC B细胞形成的统计图。*:P＜0.05；**:P＜0.01；***:P＜0.001。Fig.6 WK429 inhibited the formation of GC B cells in vitro(A)The rate of B220+GL7+GC B cells was analyzed by flow cytometry；(B)The rate of GC B cells was calculated.*:P＜0.05；**:P＜0.01；***:P＜0.001.

动物免疫后第 14天,取小鼠脾脏检测浆细胞的形成情况。流式细胞术分析结果表明,与Control组相比,50 mg/kg WK429给药组脾脏中记忆B细胞的比例不变(P＞0.05),这表示WK429不影响记忆B细胞的形成(图10A,C)；但是,浆细胞的比例明显降低(P＜0.01),从0.90%下降到0.26%,并且低于50 mg/kg FX1阳性组脾脏中浆细胞的比例(0.33%)(图10B,D),这表明WK429抑制浆细胞的形成。此外,与Control组相比,50 mg/kg WK429给药组中抗体IgG的含量明显降低(P＜0.05),这表示抗体IgG的产生受到抑制(图10E)。以上实验结果表明,WK429抑制浆细胞的形成和抗体IgG的产生。

图7 WK429体外抑制浆细胞的分裂和形成(A)WK429抑制浆细胞分裂的流式图；(B)WK429抑制浆细胞形成的流式图；(C)WK429抑制浆细胞分裂的统计图；(D)WK429抑制浆细胞形成的统计图。**:P＜0.01；***:P＜0.001。Fig.7 WK429 inhibited the division and formation of plasma cells in vitro(A)The division of plasma cells was analyzed by CFSE；(B)The rate of plasma cell was analyzed by flow cytometry；(C)The division of plasma cells was calculated；(D)The rate of plasma cells was calculated.**:P＜0.01；***:P＜0.001.

3 讨论

目前,研究者在多种自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)和重症肌无力(myasthenia gravis,MG)等患者或动物模型中均发现GC的形成和自身抗体的产生[15～16,20]。Tfh细胞是一种新发现的T细胞亚群,专门用于刺激GC的形成以及在GC中选择高亲和力的B细胞,有助于抗体产生[21～23]。针对Tfh细胞在自身免疫性疾病中的作用,人们主要在小鼠模型中进行探索,研究表明易患疾病的小鼠中存在大量的Tfh细胞[24]。此外,研究者发现循环Tfh细胞中BCL6的表达与系统性红斑狼疮全身疾病的活动呈正相关[25]。在Tfh细胞分化过程中,BCL6表达上调,缺失BCL6的T细胞不能分化为Tfh细胞,而持续性表达BCL6可以增强Tfh细胞的分化能力。此外,增殖后的GC B细胞从暗区迁移到亮区,在这里,Tfh细胞帮助GC B细胞进一步进行抗体类别转换和阳性细胞选择[23,26～28]。Tfh细胞和GC B细胞都是GC反应不可或缺的,在这两种细胞类型中BCL6的缺失会导致GC反应的终止[29]。

图8 WK429体内抑制Tfh细胞和GC B细胞的形成(A)WK429抑制Tfh细胞形成的流式图；(B)WK429抑制GC B细胞形成的流式图；(C)WK429抑制Tfh细胞形成的统计图；(D)WK429抑制GC B细胞形成的统计图；(E)WK429对总B细胞比例的影响。*:P＜0.05；**:P＜0.01。Fig.8 WK429 inhibited the formation of Tfh cells and GC B cells in vivo(A)The rate of CXCR5+PD-1+Tfh cells was analyzed by flow cytometry；(B)The rate of B220+GL7+FAS+GC B cells was analyzed by flow cytometry；(C)The rate of Tfh cells was calculated；(D)The rate of GC B cells was calculated；(E)Effect of WK429 on the rate of total B cells.*:P＜0.05；**:P＜0.01.

越来越多的研究表明,BCL6是一个潜在的药物靶点[30]。在GC反应过程中,BCL6的基因发生易位和点突变,导致BCL6蛋白持续性高表达,从而促进B细胞恶性增殖,驱动GC衍生淋巴瘤的发生[9]。在肿瘤中,阻断BCL6-BTB与其转录共抑制子之间的蛋白质-蛋白质相互作用是治疗弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)的有效策略[31]。近年来,BCL6抑制剂不断涌现[32～38],但大部分都是针对肿瘤方面的研究,而且目前BCL6抑制剂也存在诸多问题,比如:细胞水平活性低、生物利用度差和溶解性差等。大部分BCL6抑制剂只有体外数据,体内数据尚未报道。尽管阳性化合物FX1在体内外均存在抗肿瘤活性,但是其溶解度不高。因此,本文以BCL6为靶点,开发针对BCL6BTB结构域的新型高效的小分子抑制剂。

图9 WK429体内抑制生发中心的形成(A)WK429抑制生发中心形成的免疫荧光图(标尺:100 μm)；(B)WK429抑制生发中心形成的的统计图。***:P＜0.001 vs.对照组。Fig.9 WK429 inhibited the formation of GCs in vivo(A)Representative staining of GC was analyzed by immunofluorescence(scale bar:100 μm)；(B)The areas of GC was calculated.***:P＜0.001,compared with the control group.

通过HTRF筛选体系,我们从小分子化合物库筛选到WK429。在体外,WK429能够抑制PBMC产生炎症因子 IL-6、TNF-α、IFN-γ 和 IL-17A,抑制Raw264.7细胞产生炎症因子 IL-1β、IL-6、IL-12p40和TNF-α,表明WK429具有抑制炎症的作用,这与阳性化合物FX1的抗炎作用一致。研究表明,BCL6抑制剂FX1能够降低炎症因子的产生,减弱巨噬细胞的浸润活性,并提高患有脓毒症小鼠的存活率[39]。在体内动物实验中,WK429不仅抑制Tfh细胞和GC B细胞的形成,而且显著降低浆细胞的形成和抗体IgG的产生,表明WK429通过对Tfh细胞和GC B细胞的影响,抑制GC反应,最终起到调节体液免疫反应的作用。与阳性药物FX1腹腔注射给药相比,WK429可以口服给药,更具有成药的潜力。此外,与WK429给药组相比,阳性药物FX1明显影响总B细胞的形成。虽然存在BCL6多肽类抑制剂BPI-1治疗系统性红斑狼疮的个例报道,但是多肽属于大分子药物,而大分子药物一般作用于细胞表面的靶点,抑制蛋白质相互作用,特异性强,不能口服,难以进入细胞内,即使改造后可以进入细胞内,多肽类药物的费用也较高。从市场份额来看,小分子药物占有率达70%,而且小分子化合物可以口服,能够进入细胞内作用于胞内靶点。总的来讲,本研究系统性地评价了小分子化合物WK429抑制炎症和降低体液免疫反应的作用,具有为体液免疫反应过强的自身免疫性疾病的预防或治疗提供新策略的潜力。

图10 WK429体内抑制浆细胞的形成和抗体IgG的产生(A)记忆B细胞的流式图；(B)WK429抑制浆细胞形成的流式图；(C)记忆B细胞占比的统计图；(D)WK429抑制浆细胞形成的统计图；(E)WK429抑制抗体IgG产生。ns:P＞0.05 vs.对照组；*:P＜0.05 vs.对照组；**:P＜0.01 vs.对照组。Fig.10 WK429 inhibited the formation of plasma cells and the production of IgG antibody in vivo(A)The rate of CD38+IgG1+memory B cells was analyzed by flow cytometry；(B)The rate of B220-CD138+plasma cells was analyzed by flow cytometry；(C)The rate of memory B cells was calculated；(D)The rate of plasma cells was calculated；(E)WK429 inhibited the production of IgG antibody.ns:P＞0.05,compared with the control group；*:P＜0.05,compared with the control group；**:P＜0.01,compared with the control group.