云南松松塔对肺纤维化大鼠炎症因子的作用

李彩虹，李银蕊，胡 赞，母育成，李春艳，陈俊雅

云南松松塔对肺纤维化大鼠炎症因子的作用

李彩虹，李银蕊，胡 赞，母育成，李春艳，*陈俊雅

（大理大学药学与化学学院，云南，大理 671000）

探讨云南松松塔提取物（Extracts from the pinecone of，PE）对肺纤维化大鼠血清炎症因子水平的影响。SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性组（5 mg/kg醋酸泼尼松龙）及PE高、中、低剂量组（200、100、50 mg/kg）。采用气管内一次性注射0.2 mL博来霉素生理盐水溶液（5 mg/kg）建立大鼠肺纤维化模型，假手术组气管内给予0.2 mL无菌生理盐水。造模后第2 d开始给予相应药物，分别于实验第7、14、28 d，处死1/3的大鼠，测定大鼠肺系数，酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定血清中羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）、转化生长因子beta 1（Transform growth factor beta 1，TGF-β1）、肿瘤坏死因子alpha（Tumor necrosis factor alpha，TNF-α）的含量，苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin，HE）染色考察肺脏组织病理学变化。与假手术组比较，模型组大鼠在第7、14、28 d肺系数、血清HYP、TGF-β1、TNF-α含量均明显升高（< 0.05，< 0.01）；与模型组比较，PE中、高剂量组可以不同程度的减小肺系数（< 0.05，< 0.01），降低血清中TGF-β1、TNF-α及HYP含量（< 0.05，< 0.01）。HE染色显示PE中、高剂量组大鼠肺泡结构损伤及炎性细胞浸润均较模型组明显减轻。云南松松塔可以改善博来霉素诱导肺纤维化大鼠的炎症反应和胶原沉积情况。

肺纤维化；云南松松塔；转化生长因子β1；肿瘤坏死因子α；羟脯氨酸

特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种限制性肺间质疾病，在其发展过程中，常伴随间质性肺炎在组织结构上的发展，成纤维细胞灶中纤维原细胞和肌成纤维细胞的积聚，以及炎症因子浸润和胶原过度沉积等病理学改变。病人常因肺泡毛细管的纤维化而导致呼吸障碍甚至导致死亡[1]，确诊后中位生存期仅有2~3年[2]。由于该疾病缺乏有效治疗手段，且预后较差，日益引起学界重视。

云南松（Franch.）是我国西南林区的主要树种之一，主要生长在海拔600~3100 m地带。云南松松塔是云南松的球果，味甘、苦、性温、无毒[3]。前期研究发现，云南松松塔提取物可降低肺纤维化大鼠肺组织匀浆中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，增强总抗氧化能力（Total-antioxidant capacity，T-AOC），从而减轻博来霉素导致的肺纤维化大鼠肺组织氧化应激损伤，改善肺组织的弹性、质地及肿胀程度[4]。因此本试验采用气管内一次性注射博来霉素建立肺纤维化大鼠模型，通过考察不同时间点肺纤维化大鼠组织病理学改变，血清中HYP、TNF-α以及TGF-β1含量的变化，进一步探讨云南松松塔提取物对肺纤维化大鼠炎症因子的影响，从而揭示其抗肺纤维化作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

药材采自云南省大理白族自治州大理市苍山东坡斜阳峰，经大理大学药学与化学学院刘光明教授鉴定为松科松属植物云南松的松塔。松塔经自然晾干后粉碎，用95%乙醇浸泡3次，1%氢氧化钠提取，过滤；滤液分别用1倍量、2倍量、5倍量95%乙醇沉淀，合并沉淀物，减压干燥，得到云南松松塔提取物（Extracts from the pinecone of，PE）。博来霉素（浙江海正辉瑞，批号：16037911），醋酸泼尼松龙片（上海上药信谊，批号：017160801），大鼠TGF-β1 ELISA试剂盒（深圳欣博盛，批号：R170418-107a），大鼠TNF-α ELISA试剂盒（深圳欣博盛，批号：R170418-102a），羟脯氨酸测试盒（南京建成，批号：20170413）。

1.2 动物

SPF级Sprague Dawley（SD）大鼠144只，雌雄各半，体质量(180 ± 20) g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（湘）2014-0005。试验前，大鼠适应性饲养1周，自由饮水饮食。

1.3 仪器

JR-30鼠恒温实验台（成都泰盟），Biotek全波长酶标仪（Biotek公司），EL104电子天平（梅特勒-托利多），莱卡DM2000显微镜（德国莱卡），DHP-9272B电热恒温培养箱（上海一恒）。

1.4 方法

1.4.1 模型制备与分组给药

SD大鼠根据体重随机分为假手术组、模型组、阳性组、PE低、中、高剂量组，每组雌雄各半。实验前大鼠肌肉注射20%乌拉坦溶液麻醉，固定于大鼠恒温实验台上，颈正中部位切口并暴露气管，除假手术组外，所有大鼠气管内一次性注入博来霉素（5 mg/kg）溶液0.2 mL，假手术组注入等量生理盐水，迅速缝合肌肉层和皮肤层，然后将大鼠直立并轻轻旋转恒温实验台15 s，以使药液在肺内分布均匀[5]。造模次日开始给药，阳性组灌胃5 mg/kg醋酸泼尼松龙溶液，PE低、中、高剂量组分别灌胃50、100、200 mg/kg 云南松松塔提取物溶液，模型组灌胃等量生理盐水，各组均按0. 2 mL/10 g体重连续给药，1次/d，假手术组不给药，然后分别于实验第7、14、28 d，分别处死1/3大鼠。

1.4.2 大鼠肺系数测定

每批大鼠处死后，迅速摘取肺组织，预冷生理盐水漂洗污血，滤纸吸干水分并称重，按照下式计算肺系数：肺系数=肺重（mg）/体重（g）。

1.4.3 血清TGF-β1、TNF-α及HYP含量测定

给药结束后，乌拉坦麻醉大鼠，腹主动脉取血，4 ℃条件下3000 rpm离心10 min，取上清，-80 ℃分装保存，按照试剂盒说明书测定血清中TGF-β1、TNF-α及HYP的含量。

1.4.4 组织病理学检查

取大鼠左肺上叶固定于10 %福尔马林溶液，乙醇脱水，石蜡包埋，4 μm切片，常规HE染色，显微镜下观察大鼠组织病理学变化。

1.5 统计学分析方法

2 结果

2.1 肺组织病理学变化

HE染色发现（图1），假手术组大鼠肺组织切片肺泡结构完整，边界清晰，肺泡间隔正常，肺泡内及肺泡间隔无明显炎症细胞。模型组大鼠肺泡壁急剧增厚，实变区增多，肺泡结构紊乱近乎消失，呈弥漫性肺纤维化，且随时间延长纤维化程度逐渐加重。阳性组及PE低、中、高剂量组肺组织有不同程度的肺泡间隔变宽，肺泡结构破坏以及炎性细胞浸润，但远较模型组轻，PE低剂量组大鼠肺组织在第28 d出现较明显纤维化。

图1 大鼠肺组织病理学变化（HE，×100）

2.2 肺系数

与假手术组比较（表1），在第7、14、28 d三个时间点，模型组大鼠肺系数均显著高于假手术组（< 0.01）；与模型组比较，阳性组、PE高和中剂量组在第7、14、28 d的肺系数均降低（< 0.01，< 0.05）。

表1 大鼠肺系数变化（± s，n = 8）

注：与假手术组比较，*< 0.05，**< 0.01；与模型组比较，#< 0.05，##< 0.01

2.3 血清TGF-β1含量测定

与假手术组比较（表2），模型组大鼠血清TGF-β1含量在第7、14、28 d均明显升高（< 0.05，< 0.01）；与模型组比较，阳性组及PE高、中剂量组大鼠血清TGF-β1含量在第14、28 d明显降低（< 0.05，< 0.01）。

表2 PE对大鼠血清中TGF-β1含量的影响（± s，n = 8）

注：与假手术组比较，*< 0.05，**< 0.01；与模型组比较，#< 0.05，##< 0.01

2.4 血清TNF-α含量测定

与假手术组比较（表3），模型组大鼠血清TNF-α含量在第7、14、28 d均显著升高（< 0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清TNF-α含量在第7、14、28 d三个时间点（PE低剂量组在第7 d除外）均明显降低（< 0.05，< 0.01）。

表3 PE对大鼠血清中TNF-α含量的影响（ ± s，n = 8）

注：与假手术组比较，*< 0.05，**< 0.01；与模型组比较，#< 0.05，##< 0.01

2.5 血清HYP含量测定

与假手术组比较（表4），模型组大鼠血清HYP含量在第14、28 d明显升高（< 0.01）；与模型组比较，阳性组、PE高剂量组在第14、28 d三个时间点的HYP含量均明显降低（< 0.01）。

表4 PE对大鼠血清中HYP含量的影响（ ± s，n = 8）

注：与假手术组比较，*< 0.05，**< 0.01；与模型组比较，#< 0.05，##< 0.01

3 讨论

试验采用气管内一次性注射博来霉素建立肺纤维化大鼠模型。博来霉素常作为化疗药物可用于治疗癌症，但具有明显的肺脏毒性，易导致肺损伤和纤维化等[6]。正常情况下，博来霉素由博来霉素水解酶代谢，但是肺脏中水解酶的缺乏导致肺脏对博来霉素的毒性非常敏感[7]。高浓度博来霉素可以引起DNA链断裂，产生自由基，诱导氧化应激并最终导致细胞坏死和/或凋亡[8]。前期研究表明，云南松松塔可降低博来霉素诱导的肺纤维化大鼠肺组织匀浆MDA含量，提高T-AOC活力，从而减轻氧化应激损伤，改善肺组织质地及减轻肿胀程度。肺系数的高低是反映肺纤维化程度、肺实变的最直观指标之一[9]。结果显示，与假手术组比较，大鼠模型组在第7、14、28 d三个时间点的肺系数均明显增大；与模型组比较，各给药组（PE低剂量组除外）在三个时间点的肺系数均明显减小，说明肺纤维化模型制备成功。

博来霉素能够引起大鼠肺组织急性炎症，促进巨噬细胞等炎症细胞的聚集以及成纤维细胞的激活[10]。肺组织病理学检查结果显示，肺纤维化模型大鼠肺泡壁增厚，结构被破坏，且可见炎性细胞浸润及弥漫性肺纤维化，随时间延长纤维化程度逐渐加重；与相同时间点的模型组相比，PE中、高剂量组均表现出肺泡结构损伤及肺泡间隔增厚程度明显减轻，炎性细胞浸润减少，纤维化程度降低。

在肺纤维化进程中，核因子kappaB（Nuclear factor-κB，NF-κB）在上皮损伤中发挥重要作用。它最初释放一些包括白细胞介素（Interleukin 1，IL-1）、TNF-α等促炎因子，促进炎症细胞，例如循环成纤维细胞和骨髓间质祖细胞向肺组织趋化。接下来NF-κB激活TGF-β1的表达，作为肺纤维化进程中关键的中间介质，TGF-β1可以诱导上皮间质转化，产生上皮来源的成纤维细胞，激活成纤维细胞和成纤维细胞样细胞过度合成胶原，最终导致肺纤维化[11]。结果发现，与模型组比较，在第7、14、28 d PE中、高剂量组大鼠血清TNF-α含量均明显降低，第14、28 d血清TGF-β1含量明显降低，从而在给予PE后使TNF-α等促炎因子的释放减少以及因NF-κB激活TGF-β1导致的表达降低。

另外，肺纤维化发生时，肺组织内增加的主要成分是胶原纤维，而HYP为胶原蛋白所特有，是胶原纤维沉积的代表指标，因此HYP能间接反映肺组织中胶原代谢情况[12]。本实验中，在7、14、28 d三个时间点PE高剂量组大鼠血清HYP含量相比模型组均明显降低，PE中、低剂量组大鼠血清HYP含量低于模型组，说明云南松松塔能够减少肺纤维化形成过程中胶原过度合成和沉积。

研究发现，在云南松松塔中含有大量二萜类化合物[13-14]、酚类化合物[15]、黄酮类[16]及多糖[17]等成分。而这些物质具有广泛的生物活性，如二萜类化合物的抗炎[18]、保肝[19]、抗肿瘤[20]等作用。在本实验中也发现，给予肺纤维化模型大鼠不同剂量云南松松塔提取物之后，在各个时间点，高、中剂量松塔提取物均能降低大鼠血清中促炎因子TNF-α含量，并减少血清中促纤维化因子TGF-β1的含量，说明松塔抗纤维化作用的发挥可能与减轻促炎因子分泌有关。

根据《本草纲目》记载，云南松松塔具有祛痰、止咳、平喘等功效，说明其在呼吸系统疾病方面早有应用。文献报道云南松松塔不同极性部位对不同状态豚鼠离体气管平滑肌具有解痉作用，对肠鼠静息和致痉离体气管平滑肌有松弛作用[21]。同时本次实验发现，云南松松塔提取物可以改善大鼠病理状态，减少促纤维化因子TGF-β1释放和促炎因子TNF-α的释放，从而延缓肺纤维化进程，表明云南松松塔提取物具有一定的抗肺纤维化作用，这种作用主要与减少炎症因子TNF-α的释放、降低TGF-β1的表达以及减少胶原过度沉积有关。

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EFFECT OF THE PINECONE OFON INFLAMMATORY FACTORS IN RATS WITH PULMONARY FIBROSIS

LI Cai-hong, LI Yin-rui, HU Zan, MU Yu-cheng, LI Chun-yan,*CHEN Jun-ya

(College of Pharmacology and Chemistry, Dali University, Dali, Yunnan 671000, China)

To study the effects of the extracts from pinecone ofon inflammatory factors of rats with pulmonary fibrosis.SD rats were randomly divided into sham-operated group, model group, positive group (5 mg/kg prednisolone) and PE high, middle and low dosage groups (200, 100, 50 mg/kg). The pulmonary fibrosis model was established by intratracheally administration 0.2 mL bleomycin (5 mg/kg), and the rats in sham-operated group were given 0.2 mL normal saline. The corresponding drugs were administrated to the rats from the 2ndday, and then the 1/3 rats in each group were sacrificed to the 7th, 14thand 28thd, respectively. Finally, the lung index was determined. The contents of HYP, TGF-β1, TNF-α in serum were determined through ELISA, and histopathological change was investigated by HE staining.The lung index, contents of HYP, TGF-β1, TNF-α in serum of rats in model group were significantly increased (< 0.05,< 0.01) compared with sham-operated group. Compared with the model group, the lung index, the contents of TGF-β1, TNF-α and HYP in PE high and middle dose groups decreased apparently (< 0.05,< 0.01). Histopathological sections showed damaged alveolar structure and inflammatory cells infiltration were alleviated in PE middle and high groups compared with the model group.The pinecone ofcould ameliorate lung fibrosis, inflammatory response and collagen deposition in rats with pulmonary fibrosis induced by bleomycin.

pulmonary fibrosis; pinecone of; transform growth factor β1; tumor necrosis factor α; hydroxyproline

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2020.05.016

1674-8085(2020)05-0092-06

2020-02-26；

2020-04-17

云南省科技厅应用基础研究青年项目（2017FD137）；大理大学大学生科研基金项目(KYSX201682)

李彩虹(1996-)，女，青海西宁人，大理大学药学与化学学院药学专业2014级本科生(E-mail:3142936275@qq.com);

李银蕊(1997-)，女，云南昆明人，大理大学药学与化学学院药理学专业2019级研究生(E-mail:18760968074@163.com);

胡 赞(1996-)，男，陕西汉中人，大理大学药学与化学学院药学专业2014级本科生(E-mail:1135468696@qq.com);

母育成(1996-)，男，四川广元人，硕士生，主要从事中药药理学研究(E-mail:1281635327@qq.com);

李春艳(1982-)，女，云南临沧人，讲师，硕士，主要从事中药药理学研究(E-mail:lcyyanyan@126.com);

* 陈俊雅(1986-)，男，河南周口人，实验师，硕士，主要从事中药药理学研究(E-mail:langcjy@126.com).