逸心汤对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究

辛福顺，吴埼淇，张 韬，林敏瑜，林绍彬

近年来，随着溶栓疗法、经皮冠状动脉介入术、冠状动脉旁路移植术等的广泛应用，使心肌细胞缺血后重新得到血液灌注。多数情况下，心肌缺血经再灌注后功能可得到恢复，但有时心肌功能不仅不能恢复，反而出现比灌注前更严重的损伤和功能障碍，主要表现为舒缩功能降低、再灌注心律失常、心肌能量代谢障碍、超微结构变化及血管无复流等现象，甚至出现永久性伤残或死亡。这种在缺血基础上恢复血流后，心肌组织损伤反而加重的现象称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。心肌缺血是多因素、多基因共同参与的复杂过程，尽管临床实践表明西药治疗心肌缺血的近期疗效尚可，但其远期疗效不甚理想。近年来，大量的研究结果表明，中药对心血管疾病具有积极的疗效。前期临床研究显示，逸心汤治疗慢性心力衰竭及稳定型心绞痛取得良好的临床疗效，本研究通过构建大鼠MIRI模型，从氧化应激及细胞凋亡角度探讨逸心汤对MIRI的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 30只成年雄性SD大鼠，清洁级，体质量(250±20)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK(沪)2017-0005。

1.2 实验材料 石蜡(Sigma)，DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，中性树胶(Sigma)、Tunel试剂盒(KGA704南京凯基生物科技发展有限公司)，内源性亲和素-生物素封闭试剂盒(北京雷根生物技有限公司)，丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，活性氧(ROS)酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)。

1.3 实验药物 逸心汤由丹参、瓜蒌、半夏、薤白、桃仁、红花、茯苓、黄芪等 12 味药物组成。由本实验中心动物技术员以每包逸心汤统一加水120 mL，煎煮30 min至沸腾，共计煎煮5包，汤药560 mL，1 h后按每只4 mL、每日1剂经胃管注入。

1.4 主要实验仪器 小动物麻醉呼吸机(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；Powerlab数据采集分析系统(澳大利亚埃德公司)；台式高速冷冻离心机(湘仪)，型号：H1650R；多功能酶标分析仪(汇松)，型号：MB-530；紫外分光光度计(天普)，型号：752；切片机(浙江金华益迪试验器材)，型号YD-315；包埋机(常州中威电子仪器)，型号BMJ-A；显微镜(Motic)，型号：BA210T。

1.5 实验方法

1.5.1 大鼠MIRI模型制备 大鼠诱导吸入异氟烷，维持麻醉状态，仰卧位固定，经喉气管插管，接入小动物呼吸麻醉机，进气量按100 g进气1～1.5 mL，呼吸频率为90～100次/min。将针刺电极插入大鼠左下肢、右上肢皮下，通过Powerlab生理记录仪记录肢体导联心电图(ECG)。记录15 min正常时的心电图后，剔除心电图异常者。在胸骨左旁开0.5 cm处做一约2 cm的纵向切口，大致位于两前肢后缘连线至第5肋骨水平。分离皮下筋膜，钝性分离第3肋、第4肋的胸浅肌和胸深肌，剪断第3肋、第4肋骨，剪开心包膜，暴露心脏，确认左前降支的位置。于左心耳下缘约2 mm处的冠状动脉左前降支下穿6-0号带针缝合线，从肺动脉圆锥旁出针，拉紧丝线，观察心电图改变和心肌颜色变化，见到结扎部位上下约2 mm范围的心肌颜色发白，心电图ST段抬高说明结扎成功。结扎45 min后，剪开线结进行再灌注，心肌由苍白变得红润，在开始灌注的时候会出现再灌注心律失常。随后胸前切口逐层缝合，用注射器抽吸清除胸腔内残留气体，关胸后予以脱机，放回笼中。

1.5.2 实验分组 按照随机对照原则，将30只大鼠分为空白组(假手术组)、模型组和治疗组各10只。模型组和治疗组分别结扎心脏左前降支45 min，空白组只穿线不结扎，其余步骤各组均相同。模型组和空白组灌胃生理盐水4 mL，连续治疗2周。治疗组给予逸心汤，每只4 mL，每日1剂，每天灌胃给药，治疗2周。

1.6 指标检测

1.6.1 氧化应激水平评价 治疗2周后，各组大鼠均用2%戊巴比妥钠，按100 g体重0.3 mL腹腔注射麻醉后，腹主动脉采血，采用相应试剂盒检测各组大鼠血清SOD、MDA及ROS水平。

1.6.2 心肌细胞凋亡检测 治疗2周后，各组大鼠均用2%戊巴比妥钠，按100 g体重0.3 mL腹腔注射麻醉后，用生理盐水心脏灌注后，取整个心脏放在4%多聚甲醛中固定后，并取心肌组织进行病理苏木精-伊红(HE)染色，采用TUNEL法检测各组大鼠心肌细胞凋亡水平。

1.6.3 心肌组织病理HE染色 每只动物取心脏同一部位组织，经过烤片、切片、脱腊、浸洗、苏木精及伊红染色、冲洗、脱水、封片，显微镜下观察。

2 结 果

2.1 各组氧化应激指标比较 模型组MDA水平明显高于空白组(P<0.05)，治疗组MDA水平明显低于模型组(P<0.05)，治疗组MDA水平与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。3组间SOD水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组ROS水平明显高于空白组(P<0.05)，治疗组ROS水平明显低于模型组(P<0.05)，但高于空白组(P<0.05)。详见表1。

表1 各组氧化应激指标比较(±s)

2.2 各组细胞凋亡水平比较 治疗组、模型组心肌细胞凋亡水平明显高于空白组(P<0.05)；模型组与治疗组心肌细胞凋亡水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组心肌细胞凋亡水平比较(±s)

2.3 各组心肌组织病理HE染色结果 病理组织形态学结果显示，模型组、治疗组与空白组比较，可见心肌细胞变性，心肌纤维断裂，心肌细胞间隙明显增宽，炎细胞浸润，而治疗组与模型组比较，心肌细胞变性及炎细胞浸润程度较轻。详见图 1。

图1 各组心肌组织病理切片图(HE，×400)

3 讨 论

MIRI的发生是由多环节、多因素共同促成，其病因复杂。目前认为氧自由基产生、钙超载、凋亡基因的激活在MIRI中起着重要作用[1]。氧化应激是MIRI的重要原因之一，由此，可以通过测定氧化应激相关指标，来了解体内氧化及抗氧化水平。MDA是脂质过氧化过程的副产物之一，可间接地反映自由基攻击的严重程度，其含量高低反映了氧自由基在细胞内的生成水平及其对细胞的损伤程度[2]。SOD是体内清除自由基的主要成分，其活力可反映机体清除氧自由基的能力[3]。ROS是线粒体产生的一种体内代谢产物，过度累积的ROS可造成粥样硬化斑块不稳定，甚至破裂等情况，从而引起心脑血管事件[4]。因此，可以通过测定MDA、SOD、ROS的含量来评价MIRI氧化应激水平。在本研究中，模型组及治疗组MDA、ROS明显高于空白组，说明结扎左前降支的模型组和治疗组大鼠均存在MIRI，其氧自由基水平增高，且治疗组MDA及ROS水平明显低于模型组，表明逸心汤对MIRI具有一定的保护作用。但在本研究中3组间SOD比较差异无统计学意义，可能与促氧化、抗氧化失衡有关，但不排除与样本量小有关，有待进一步研究。

本研究采用结扎大鼠心脏左前降支的方法制备急性心肌梗死模型，该造模方法成功率高，操作简便，与临床急性心肌梗死相似，是急性心肌梗死常用的动物造模方法[5]。在本研究中，结扎心脏左前降支的治疗组与模型组心肌细胞凋亡水平均明显高于空白组，但治疗组与模型组心肌细胞凋亡水平比较差异无统计学意义，考虑可能与样本量较小有关。

逸心汤中以丹参、瓜蒌为君药，二药合用有助于加强祛痰化瘀、改善微循环的作用，再配以半夏、薤白、桃仁、红花、茯苓、黄芪为臣药，诸药合用具有益气化痰祛瘀之功效，在前期慢性心力衰竭及稳定型心绞痛的临床观察中亦取得了良好的疗效[6-7]，体现了验方逸心汤“辨证论治，治病求本”的精髄，也符合当前精准化、个体化治疗的理念。

现代研究表明，瓜蒌在抗动脉粥样硬化的过程中具有调节脂质代谢、抗炎、抗氧化、抗血管内皮损伤、抑制平滑肌细胞增殖、稳定斑块、扩血管、抑制血小板血栓形成，延长缺氧耐受时间，改善缺血再灌注损伤等作用[8-9]。丹参、川芎能改善心肌舒缩功能，清除氧自由基，改善MIRI，促进心功能恢复[10]。桃仁、红花可有效改善血小板聚集和凝血功能，扩张冠状动脉[11]。薤白有保护内皮并改善其功能紊乱，改善心肌缺血，从而保护衰竭的心肌细胞的作用[12]。

综上所述，逸心汤具有活血化瘀、祛痰通络的功效，对MIRI有一定的保护作用，其机制可能与多靶点调节血管内皮细胞功能，抗血小板聚集，改善氧化应激损伤，从而减少心肌损害有关[6]。