心房颤动病人射频消融前后miRNA-328、miRNA-223表达与预后的关系

肖金平，付景秋，李小雷，陈 俊

心房颤动是临床常见的一种心律失常，成人发病率为0.3%左右，60～74岁老年人发病率高达8.0%左右[1]。随着心力衰竭、糖尿病、高血压等危险因素的增加，心房颤动患病率越来越高。男性发生心房颤动的危险是女性的1.5倍左右，心房颤动不但可加重原有心脏疾病，还可引起血栓形成和栓塞，比如脑栓塞、肢体动脉栓塞等严重并发症，增加病人的死亡率和致残率[2-3]。心房颤动的病因与发病机制多样，包括自主神经系统、电重构、解剖重构、局灶触发及多子波折返、肾素-血管紧张素-醛固酮系统等[4]。在治疗中，由于发病机制没有得到明确阐述，为此无论是药物、射频消融、外科手术、植入式心房除颤器、双心房起搏等手段，对心房颤动的复律、窦性心律维持的预防和治疗都无根治性效果[5]。但射频消融造成心肌热损伤，产生瘢痕组织，成为心肌电传导的绝缘带，可以替代心房切割-缝合，使手术操作过程简化，可能有更好的预后效果[6]。miRNA是一种基因表达调控因子，从理论上来讲，miRNA若将心房颤动电重构与结构重构相关的蛋白基因作为靶基因，则就与心房颤动形成及持续存在相关性。近年来研究发现，miRNA参与调控心房颤动时心肌组织的电重构、离子重构和结构重构，其涉及的机制包括细胞内钙超载、心房局部肾素-血管紧张素系统激活、心房肌组织纤维化、通道和受体蛋白的改变、钙依赖性中性蛋白酶变化等[7]。miRNA通过多途径参与上述因素的调节，最后表现为促心房颤动或抗心房颤动、促凋亡或抗凋亡等[8]。本研究观察心房颤动病人射频消融术前与术后相关miRNA表达水平变化，了解射频消融术对心房颤动相关因子miRNA表达的影响，进一步分析心房颤动病人射频消融术前后miRNA表达的影响与预后相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年9月—2018年5月在我院心内科住院的心房颤动病人62例。纳入标准：心电图确诊为心房颤动，既往有确切的心房颤动病史；合并二尖瓣关闭不全；存在二尖瓣置换术适应证(瓣叶穿孔、腱索断裂、成形手术难以完全矫正或成形手术失败)；未治疗状态下坐位时血压≥140/90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)；年龄20～80岁；病人知情同意本研究并签署知情同意书；预计生存期大于3个月。排除标准：合并恶性肿瘤、近期感染、结缔组织病、自身免疫性疾病及严重肾功能不全病人；妊娠期间出现心房颤动等。62例病人中男32例，女30例；年龄28～74(56.34±4.19)岁；吸烟34例；左房内径(56.35±8.45)mm；心胸比0.63±0.05；左室射血分数0.56±0.07；合并疾病：冠心病22例，糖尿病21例，高血压34例，风湿性心脏病11例；舒张压(73.45±8.21)mmHg，收缩压(130.24±13.98)mmHg；疾病类型：按照2006年《美国心房颤动治疗指南》分类为阵发性心房颤动30例，持续性心房颤动20例，长期持续性心房颤动12例。

1.2 治疗方法 所有病人在二尖瓣置换术同期直视下进行射频消融术治疗，选择Stockertep Shuttle射频消融仪和CRTO快速三维心内膜电解剖标测系统。术前常规进行全身检查与生命体征的检测，了解肺静脉解剖、肺静脉走行、肺静脉开口位置与左心房的关系。病人局部麻醉下穿刺左锁骨下静脉及右股静脉，常置10极冠状静脉窦电极导管，穿刺房间隔2次并保留鞘于左心房，静脉注射肝素。经长鞘将7.5F四极冷盐水灌注导管送入左心房，造影定位肺静脉开口，行双侧环肺静脉线性消融及左房附加线性消融。消融参数：冷盐水流量17 mL/min；消融能量30～35 W，消融时间30～45 s，上限温度45 ℃，消融终点为两侧肺静脉实现电学隔离。

1.3 样本采集 收集病人住院期间血清及右心房心肌组织，采用无菌注射器抽取病人8 mL静脉血，在室温下进行低速离心5 min，将上层血浆提取出来，将血浆保存于-80 ℃冰箱中。同时所有病人术中取右心耳心肌组织约200 mg，清洗干净后心肌组织立即置于液氮中，取适量心肌组织予10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋待用。

1.4 miRNA表达检测与HE/Masson染色 采用QIAGEN公司的miRNeasy Mini Kit试剂盒对抽取的血浆提取总RNA，通过miRNA数据库查找所要研究的miRNA-328和miRNA-223的序列。逆转录成cDNA后进行实时荧光定量RT-PCR反应，严格按照Access RT-PCR System试剂盒说明书在生物安全柜中配制qRT-PCR反应体系进行操作，内标采用U6标准误。固定的石蜡心肌组织进行苏木精-伊红(HE)染色，4 μm切片后采用二甲苯脱蜡，接着各级乙醇至水洗，选取苏木精或Masson进行5 min染色，盐酸乙醇30 s分化，伊红15 s复染，采用无水乙醇进行脱水，然后二甲苯透明及中性树胶进行封固，在400倍光镜下观察。

1.5 预后观察 观察病人术后窦性心律转复情况(跨二尖瓣、三尖瓣血流A峰流速若>10 cm/s)，同时观察与记录手术前后的左心室舒张末期内径、左房直径与左室射血分数。

2 结 果

2.1 预后情况 62例病人射频消融术后窦性心律转复51例，转复率为82.3%。超声检查显示，术后病人左心室舒张末期内径、左房直径均较术前降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 心房颤动病人手术前后超声指标变化(±s)

2.2 miRNA-328、miRNA-223相对表达量 射频消融术后病人miRNA-328和miRNA-223相对表达量均低于术前，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 心房颤动病人手术前后miRNA-328、miRNA-223相对表达量比较(±s)

2.3 心肌组织病理改变 心房颤动病人心肌组织HE染色显示，心肌细胞变大，细胞核明显增大，以及肌束明显增粗，心肌细胞的排序比较紊乱。Masson染色切片可见心肌细胞染色呈红紫色，细胞走行不一，大小不均，心肌细胞增大。详见图1、图2。

图1 HE染色心肌组织病理切片(×100)

图2 Masson染色心肌组织病理切片(×400)

2.4 预后转复率与各因素的相关性分析 以全体研究对象进行分析，以预后转复率水平为应变量，以性别、年龄、合并疾病、疾病类型、吸烟行为、超声指标、心胸比、miRNA表达、收缩压、舒张压、其他危险因素为自变量，进行多元线性回归显示，miRNA-328和miRNA-223相对表达量、左房直径与舒张压为影响预后转复率的独立危险因素(P<0.05)。详见表3。

表3 心房颤动病人预后转复率与各因素的相关性分析

3 讨 论

心房颤动是最常见的心律失常之一，其发病率随着年龄增加而增加。引起心房颤动的病因复杂多样，因为它是心脑血管病的潜在并发症，所以受到临床高度关注及深入研究，但当前病理机制还不够明确。研究显示，心房颤动时心排血量减少≥25%[9]；无瓣膜病合并心房颤动较无心房颤动者脑卒中发生概率高5～7倍，脑栓塞发生率相对较高。心房颤动病理解剖学的基质为心房扩大与心房纤维化，在早期，表现出离子通道特征与电重构发生变化，心房纤维化形成在心房颤动心房结构重构改变起重要作用，最终促进心房颤动的发生与维持。本研究中心房颤动病人的心肌组织HE染色显示心肌细胞变大，细胞核明显增大，以及肌束明显增粗，心肌细胞的排序比较紊乱；Masson染色切片可见心肌细胞染色呈红紫色，细胞走行不一，大小不均，心肌细胞增大。

现代研究表明，心房颤动是由多种因素共同作用而产生的一种心律失常，具有多阶段特征，其发病因素包括电生理重构、自主神经系统失调、炎症和氧化应激、结构重构、钙离子稳态失调等，而心房结构重构是重要因素，特别是左心房大小是发生心房颤动的独立危险因素，在短时间内快速进行心房起搏，能够导致犬心房进行结构重构、收缩重构以及电重构[10-11]。

近年来，随着医学技术的发展，射频消融技术得到了广泛应用。本研究62例病人进行射频消融术后窦性心律转复51例，转复率为82.3%，术后病人的左心室舒张末期内径和左房直径均低于术前(P<0.05)。之所以取得良好的临床效果，不仅与严格病例选择有关，同时也与射频装置不断革新相关，射频装置的优点为可以透壁，避免局部温度升高太多，使得射频的热能穿透心房组织4 mm左右，避免在空白期内心房颤动的复发，改善病人远期预后。

miRNA是新发现的一类内源性非编码RNA，转录后对靶基因的mRNA分子进行调节，从而参与到多种生理病理过程[12]。现阶段，miRNAs被当作生物标志物，广泛运用于肌肉损伤等不同研究领域，能够对心肌电重构产生影响，如miRNA-133、miRNA-1通过对钾通道基因表达进行调节，可能对心脏电活动传导及节律产生影响，miRNA-27等参与钙通道的调节[13]。近年来，miRNA和心房颤动发生及维持存在密切关系，miRNA对靶基因进行调节，从而参与到心肌活动中[14]。miRNA通过对编码心房颤动电重构和结构重构基因调节，参与心房颤动的发生和维持，早期先是电生理及离子通道特征发生改变，然后出现抗凋亡或促凋亡、抗心房颤动或促心房颤动等作用[15]。

研究表明，miR-328水平与L型钙通道蛋白亚基之间存在负相关，miR-328可以发挥促心房颤动作用，当前治疗心房颤动的一个有效策略是对miR-328进行抑制[16]。比如说miRNA-29能够对胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ以及纤维素蛋白进行调控，从而引起心房纤维化，出现结构重构，最终引发心房颤动[17]。当心房颤动发生时，miRNA-1能够对钾通道产生影响，进而影响机体心肌细胞膜的电位水平，从而在心房的电重构中发挥作用[18]。本研究结果显示，射频消融术后病人miRNA-328和miRNA-223相对表达量均低于术前(P<0.05)。有研究显示，可能是miRNA-328和miRNA-223过表达降解正常胶原组织，刺激心房间质肌结缔组织、纤维组织增生，从而导致心房的扩大和心肌纤维化，形成心房颤动的易感基质[19]。本研究多元线性回归显示，miRNA-328和miRNA-223相对表达量、左房直径与舒张压为影响心房颤动病人预后转复率的独立危险因素(P<0.05)。即左房内径越大，血压越高，miRNA-328和miRNA-223表达量越高，预后就越差。miRNA-328和miRNA-22也可以通过多种途径参与心肌纤维化，心肌细胞拉长、变细，导致左心房增大。

总之，射频消融术治疗心房颤动有很好的转复效果，miRNA-328和miRNA-223表达增加可能有助于临床心房颤动的预后评估。