一种新型贝壳基质蛋白的重组表达与功能分析

孙琦，姜雨婷，徐焕志，申望，张晓林，范美华，廖智

（浙江海洋大学海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022）

贝壳是一类天然的具有纳米结构层次的生物矿化材料，其钙化层中，无机成分超过95%，主要为碳酸钙晶体，有机质成分含量较低，通常在5%以下［1］。其中，蛋白质是有机成分的主体，被称为贝壳基质蛋白（shell matrix protein，SMP）。自然界中碳酸钙晶体主要包括三种晶型，分别是方解石型（calcite）、文石型（aragonite）和球霰石型（vaterite）［2］。软体动物贝壳中的碳酸钙晶体主要有热力学性质稳定的方解石型和文石型两种，其中天然方解石型晶体多为规则立方体，而文石型晶体的形貌则取决于诱导条件，情况较为复杂［3］。贝壳生物矿化一般发生在有机-无机界面，碳酸钙晶体的形成与沉积，包括成核、生长、晶型以及形貌形成等受SMP 调控［4］；此外，贝壳中由几丁质等非蛋白质成分构成的有机框架的形成也受SMP 调控［5］。可见，SMP 在贝壳的形成以及力学性能赋予方面具有重要作用。SMP 根据其在醋酸溶液或EDTA 溶液中的溶解性分为可溶性蛋白和不溶性蛋白两大类，其中不溶性SMP 和几丁质等共同参与贝壳中疏水性有机框架的搭建［6］；而可溶性SMP 则主要负责诱导碳酸钙晶体的成核并调控其生长［7］。目前已报道的多数SMP 富含某一种或某几种氨基酸残基，例如富含酸性氨基酸残基（天冬氨酸和谷氨酸）的SMP 已被证实与生物矿化密切相关［8］；而侧链较小的氨基酸残基，包括甘氨酸和丙氨酸等，在部分SMP 序列中的高度聚集分布也被认为与SMP 形成模块化结构有关，并对生物矿化有重要影响［9］。

厚壳贻贝（Mytilus coruscus）贝壳主要由珍珠质层、肌棱柱层和纤维棱柱层构成［10］。此前已有研究利用蛋白质组学策略从厚壳贻贝贝壳中鉴定到超过60 种SMP 成分，包括碳酸酐酶、几丁质结合蛋白、丝蛋白、酪氨酸酶、蛋白酶抑制剂等［11］。其中，一种富含谷氨酰胺的贝壳蛋白（Glutamine-rich shell protein，GRSP）在厚壳贻贝贝壳肌棱柱层中被鉴定到［11］，但其在生物矿化过程中的作用及其分子机理目前尚不清楚。厚壳贻贝GRSP 序列中含有一个PDZ （postsynaptic density/discs large/zonula occludens）结构域和一个ZM（ZASP-like motif）结构域，已知含这两种结构域的蛋白在生物体内分布广泛，被认为是参与蛋白质相互作用的关键结构域［12］。为探究GRSP 在贝壳形成过程中可能发挥的作用，笔者对厚壳贻贝贝壳的GRSP 进行了序列分析，对原核重组表达以及重组GRSP 的功能进行了研究。结果表明，重组厚壳贻贝GRSP 对碳酸钙晶体的结晶速度、晶体形貌和晶型均有影响，由此推测GRSP 与贝壳的形成及发育具有重要关联。上述研究为进一步探讨GRSP 在厚壳贻贝贝壳形成过程中的分子机理奠定了基础，也为GRSP 的后续蛋白质工程改造提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 厚壳贻贝GRSP 的序列分析

厚壳贻贝GRSP 的基因序列已入GenBank 数据库，编号为AKS48171.1，通过生物信息学手段开展蛋白序列分析。其中，用Lasergene 软件（版本7.0）确定开放阅读框；用DNAman 软件进行序列比对；通过Expasy 数据库的protparam 软件（http：//web.expasy.org/protparam/）在线进行蛋白质的理化性质分析；在NCBI 网站上利用BLAST 软件（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在线进行同源序列搜索；在MEGA 软件（版本5.1）上进行多序列比对和进化树分析；用SMART 软件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在线进行结构域预测；用Signal P 5.0 软 件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/））在线进行信号肽预测；用Phyre2软件（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/）在线进行蛋白二级结构预测；通过SWISS MODEL 服务器（https：//swissmodel.expasy.org/）在线进行蛋白三级结构预测。

1.2 GRSP 的密码子优化与表达载体的构建

为获得适合大肠杆菌表达体系的目标基因，对厚壳贻贝GRSP 的cDNA 成熟肽编码的基因序列（1 788 bp）进行大肠杆菌偏爱密码子优化。在目标基因5' 端添加NcoI 限制性内切酶切位点（CCATGG）和多聚组氨酸标签；3'端添加终止密码子（TAA）和XhoI 酶切位点（CTCGAG）；最终设计出的目标基因全长1 817 bp。该目标基因由南京金斯瑞公司合成。合成后对PDZ 序列进行测序验证。表达载体采用Pet28α（+）质粒，经双酶切后，用T4-DNA 连接酶将目标基因序列与表达质粒酶切片段连接，连接产物经测序验证后转至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中。转化后的重组菌涂布于含氨苄青霉素的LB 平板，经37 ℃过夜培养，挑取单克隆菌落进行PCR 鉴定，将阳性克隆结果送至上海生工生物公司进一步测序验证。

1.3 重组厚壳贻贝GRSP 的表达、纯化及鉴定

参照文献［13］中的方法开展重组厚壳贻贝GRSP 的原核重组表达。表达产物采用Ni-NTA 亲和层析柱纯化。目标蛋白经镍柱分离纯化后，参照文献［14］中的方法进行透析复性处理。对复性后的目标蛋白进一步采用反相高效液相质谱（Waters 600 E 型，美国沃特世公司）进行脱盐和纯化。检测器为Waters 2487 双波长紫外检测器（美国沃特世公司）；色谱柱为 C4 反相色谱柱（4.6 mm×250 mm，300 Å，安捷伦）；采用二元线性梯度洗脱，其中A 液为含0.1% 三氟乙酸的纯水，B 液为含0.1%三氟乙酸的乙腈；B 液在35 min 内，其比例由30% 升 至70%；流速为1 mL·min-1；检测波长为280 nm。收集目标洗脱峰，经冷冻干燥后备用。

SDS-PAGE 采用12%分离胶，以及120 V 恒压模式，结束后用醋酸液固定20 min，以考马斯亮蓝G250 染料染色后拍照观察。

1.4 重组厚壳贻贝GRSP 的功能分析

重组厚壳贻贝GRSP 的功能分析主要包括碳酸钙晶体形貌分析、晶体晶型分析、结晶速度分析以及晶体结合分析。采用体外碳酸钙结晶诱导法［15］分析碳酸钙晶体形貌，其中，在制备方解石型碳酸钙晶体时，将CaCl2溶液置于事先放置（NH4）2CO3固体的玻璃干燥皿内进行结晶，利用（NH4）2CO3挥发出的CO2与CaCl2溶液反应获得方解石型碳酸钙晶体；在上述方法基础上，预先在CaCl2溶液中按物质的量之比为1∶4 添加MgCl2溶液，在Mg2+诱导下，CaCl2与CO2反应形成文石型碳酸钙晶体［16］。在上述反应体系中，加入重组GRSP 蛋白溶液，蛋白溶液终浓度分别为0，10，30 和50 μg·mL-1。在重组GRSP 诱导下形成的碳酸钙晶体经真空喷金处理，以场发射扫描电子显微镜（Nova nano SEM 450，美国FEI 公司）观察晶体形貌。扫描电镜采用二次电子模式收集信号，加速电压为5 kV，束斑直径为3.0 mm，工作距离为6.0～7.0 mm。

采用傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared，FTIR）并参照文献［13］中的方法进行碳酸钙晶体的晶型分析。采用Nicolet Nexus 670 红外光谱仪（美国热电公司）以透射模式测量上述步骤中经50 μg·mL-1重组GRSP 诱 导下形成 的碳酸钙 晶体。扫描范围为400～4 000 cm-1，扫描次数为32，分辨率为4 cm-1。采用Omnic 软件（版本8.2.387）对红外谱图进行分析处理。

参照文献［13］中的方法进行碳酸钙结晶速度抑制。在CaCl2溶液中加入不同浓度的重组厚壳贻贝GRSP，利用（NH4）2CO3固体所挥发的CO2与CaCl2溶液反应形成碳酸钙晶体。上述反应在96 孔板中进行，用酶标仪（Biotec H1，美国博腾公司）在600 nm 波长处进行扫描，观察碳酸钙晶体形成过程中溶液浊度的变化。

参照文献［13］中的方法进行重组厚壳贻贝GRSP 与碳酸钙晶体的结合实验。事先配置0.5 mg·mL-1重组GRSP 溶液（溶液A），加入碳酸钙晶体粉末，震荡混匀后室温孵育2 h，离心（8 000 r·min-1，15 min）后取上清（溶液B）备用；经去离子水洗涤后用5%醋酸溶液溶解沉淀物，脱钙、离心、透析后，获得溶液C。对溶液A，B，C 分别进行SDSPAGE 电泳分析。

2 结果

2.1 厚壳贻贝GRSP 是一种含PDZ 结构域的新型贝壳基质蛋白

厚壳贻贝GRSP 基因的开放阅读框全长1 788 bp，可编码由595 个氨基酸残基组成的前体蛋白，其理论分子质量为67.7 kDa，等电点pI 为9.37，是一种碱性蛋白。其核苷酸-氨基酸序列比对如图1 所示。氨基酸组成分析结果表明，厚壳贻贝GRSP 序列中含量最丰富的氨基酸为谷氨酰胺（Gln，18.2%），其次分别 为脯氨 酸（Pro，13.6%）和丝氨 酸（Ser，7.2%）。同源蛋白搜索结果表明，厚壳贻贝GRSP 在数据库中缺少高同源性蛋白。排除未知蛋白和假设蛋白后，数据库中仅有55 条同源序列的E值＜1.0 e-05。其中，得分最高的为来自虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）的一种PDLIM3（PDZ and LIM domain 3）蛋白，序列一致性仅为38.33%。在同源序列搜索结果中，选取22 条代表性序列构建系统进化树，结果见图2。由图2 可知，厚壳贻贝GRSP 的进化地位较为特殊，其进化支介于扇贝科和牡蛎科且独立成支，表明在进化上，厚壳贻贝GRSP 与其他双壳贝类的同源蛋白存在较大差异。

图3 为厚壳贻贝GRSP 的结构域与来自软体动物的同源蛋白的结构域比较，由图3 可知，厚壳贻贝GRSP 序列中无信号肽，含有一个PDZ 结构域和一个ZM 结构域（分别为肽段20～92 和497～522）。进一步比较结构域类似的GRSP 与来自软体动物的同源蛋白发现，在软体动物中，含有PDZ 和ZM 结构域的GRSP 同源蛋白，根据其序列长度和结构与分布可分为4 类，其中，第I 类为包括厚壳贻贝GRSP 在内的含PDZ 和ZM 结构域的中等序列同源蛋白（序列长度为500～800 氨基酸残基）；第II 类为含PDZ，ZM 和LIM 结构域的同源蛋白；第III 类为含PDZ 和ZM 结构域的短序列同源蛋白（序列长度在400 氨基酸残基内）；第IV 类为含PDZ 和ZM 结构域的长序列同源蛋白（序列长度在1 000 氨基酸残基以上）。厚壳贻贝GRSP 在序列长度以及结构域架构上与来自虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）的PDLIM3 蛋白，以及来自加州海兔（Aplysia californica）的trithorax 蛋白和pollen-specific leucine-rich repeat extensin-like 蛋白相似，可归为第I 类。

图1 厚壳贻贝GRSP 的cDNA 序列与开放阅读框推导的氨基酸序列比对Fig.1 The molecular sequence of Mytilus coruscus GRSP and the sequential alignment of amino acid sequence derived from its open reading frame

二级结构预测结果表明，厚壳贻贝GRSP 序列中，α-螺旋占18%，β-折叠占8%，且多数分布于序列N 端，少数分布于序列C 端；此外，无规卷曲占78%，为优势构象，如图4（a）所示。经SWISS MODEL 服务器通过同源建模方式进一步预测GRSP 的三级结构。在序列比对的基础上，分别以RCSB 数据库（http：//www.rcsb.org/）中得分最高的1v5l.1.A，2uzc.5.A，2q3g.1.A 为模板（3 种模板蛋白均为PDLIM 蛋白），构建结构模型，3 种结构模型基本一致，如图4（b）所示。厚壳贻贝GRSP 的三级结构主要包括α-螺旋、β-折叠以及无规卷曲，与二级结构预测结果基本一致。

2.2 用密码子优化策略成功表达重组GRSP

厚壳贻贝GRSP 基因序列长度为1 788 bp，经密码子优化和序列重新设计后，目标基因序列长度为1 817 bp；目标基因与pET28 表达质粒连接，其重组表达产物的理论分子质量约为80 kD，含目标基因序列和表达质粒的部分载体序列，包括多聚组氨酸标签。对优化前后的目标基因开展密码子优化指数（codon adaptation index，CAI）分析，结果见图5。经OptimumGeneTM 软件计算，优化前，GRSP 基因的CAI 为0.59；优化后，GRSP 基因的CAI 达0.87，大于0.80，意味着该目标基因在大肠杆菌中的表达效率较高［17］。

2.3 用pET28a/BL21（DE3）体系成功表达重组GRSP

重组GRSP 经IPTG 诱导表达后，以SDSPAGE 验证表达效果，结果见图6。表达菌株经IPTG 诱导，出现明显的目标蛋白条带，其分子质量约为80 kD，比预期高约10 kD，如图6（a）所示；采用抗多聚组氨酸标签的抗体通过western blot进一步分析表达产物，结果表明，目标条带含有多聚组氨酸标签，且分子质量也约为80 kD，表明表达产物正确，如图6（b）所示。在SDS-PAGE 中，由于蛋白质的特殊结构，迁移率出现异常，导致表观分子质量与其实际分子质量产生差异［18］，又由于GRSP 序列中含有高丰度的谷氨酰胺，且GRSP 是一种碱性蛋白，推测GRSP 在电泳中迁移率偏低，导致分子质量偏大。重组GRSP 的目标条带，在低温诱导下表达量极低；而在37 ℃条件下表达量较高，且均在上清和沉淀中表达，但在沉淀中表达量较大，表明重组GRSP 的原核重组表达形式主要为包涵体。重组蛋白的镍柱分离结果表明，重组蛋白可在300 mmol·L-1咪唑浓度下得到充分洗脱，如图6（c）所示。

重组GRSP 经镍柱纯化和透析复性后，进一步用反相高效液相色谱进行纯化，结果如图7 所示，收集在45%乙腈浓度时被洗脱的主峰，即为纯化的重组GRSP。

2.4 重组GRSP 可诱导碳酸钙晶体形貌的变化

图2 采用临近法绘制的厚壳贻贝GRSP 与22 条代表性同源序列进化树Fig.2 Phylogenetic analysis of Mytilus coruscus GRSP with 22 homologous sequences using the Neighbor-joining approach

图3 厚壳贻贝GRSP 的结构域与来自软体动物的同源蛋白结构域的比较Fig.3 Domain comparison of the Mytilus coruscus GRSP with the homologues from other mollusks

图4 厚壳贻贝GRSP 的高级结构预测Fig.4 The structural features of Mytilus coruscus GRSP

图5 优化前后厚壳贻贝GRSP 基因序列的密码子优化指数分布Fig.5 The CAI distribution of the gene sequence of Mytilus coruscus GRSP before and after the optimization

重组GRSP 对碳酸钙晶体体外结晶的诱导结果见图8 和图9。天然方解石型碳酸钙晶体形貌为规则的六面体形态，如图8（a）所示；作为对照组，当牛血清白蛋白（BSA）浓度为50 μg·mL-1时，对方解石型碳酸钙的结晶无明显影响，如图8（b）所示；在低浓度（10 μg·mL-1）和中等浓度（30 μg·mL-1）重组GRSP 诱导下，方解石型碳酸钙晶体形貌均无明显变化，如图8（c）和（d）所示；但在高浓度（50 μg·mL-1）重组GRSP诱导下，部分碳酸钙晶体出现叠合，如图8（e）和（f）所示，表明高浓度重组GRSP 对方解石型碳酸钙的结晶有微弱诱导作用。由图9（a）和（b）可知，天然文石型碳酸钙晶体形貌与其在BSA 作用下无明显区别，均为球状结构；而在加入不同浓度的重组GRSP 后，文石型碳酸钙晶体形貌出现了明显变化。其中，加入低浓度（10 μg·mL-1）重组GRSP 后，部分碳酸钙晶体发生轻微分裂，如图9（c）所示；加入30 μg·mL-1重组GRSP 后，大部分碳酸钙晶体发生较强分裂并出现葡萄状晶体构造；加入50 μg·mL-1重组GRSP 后，碳酸钙晶体形貌进一步变为不规则的花瓣状晶体构造，如图9（e）和（f）所示。

图6 重组GRSP 表达后的SDS-PAGE 和western blot 分析Fig.6 SDS-PAGE and western blot analyses of recombinant expressed of GRSP

图7 重组GRSP 复性后经HPLC 纯化和SDS-PAGE 分析Fig.7 HPLC purification and SDS-PAGE analysis of renaturated recombinant GRSP

图8 方解石型碳酸钙晶体在不同浓度重组GRSP 诱导下的SEM 结果Fig.8 SEM images of in vitro crystallization of calcite calcium carbonate in the presence of recombinant GRSP with different concentration

图9 文石型碳酸钙晶体在不同浓度重组GRSP 诱导下的SEM 结果Fig.9 SEM images of in vitro crystallization of aragonite calcium carbonate in the presence of recombinant GRSP with different concentration

采用傅里叶红外光谱（FTIR）分析重组GRSP对碳酸钙晶体晶型的影响，结果见图10。由图10（a）可知，重组GRSP（50 μg·mL-1）对方解石型碳酸钙晶体晶型的影响较明显，比对照组多2 个峰，即波数为1 087.72 和745.10 的峰，均为文石型碳酸钙晶体的特征峰［19］；而重组GRSP 对文石型碳酸钙晶体晶型无明显影响，见图10（b）。

2.5 重组GRSP 对方解石型碳酸钙晶体结晶速度具有抑制作用

图10 傅里叶红外光谱分析图Fig.10 FTIR spectra of the crystals collected from the crystallization experiments

用分光光度计法测定碳酸钙晶体结晶的时间，记录在重组GRSP 影响下碳酸钙晶体结晶速度变化。结果表明，重组GRSP 对方解石型碳酸钙晶体结晶速度有明显的抑制作用（P＜0.01），且在高浓度（50 μg·mL-1）条件下抑制作用较强，如图11（a）所示。但重组GRSP 对文石型碳酸钙晶体的结晶速度具有一定促进作用，低浓度时表现为轻微促进，高浓度时（50 μg·mL-1）表现为明显促进（P＜0.05），如图11（b）所示。

图11 在重组GRSP 下碳酸钙晶体结晶速度变化Fig.11 Rate change of CaCO3 crystallization rate by recombinant GRSP

2.6 重组GRSP 具有与碳酸钙晶体结合的作用

重组GRSP 具有与碳酸钙晶体结合的作用，由图12可知，重组GRSP 与方解石型以及文石型碳酸钙晶体均有明显的结合作用，经与碳酸钙晶体孵育并离心，其上清液中蛋白条带明显变弱，进一步将已结合重组GRSP的碳酸钙晶体经醋酸脱钙，重组GRSP被释放，在SDS-PAGE电泳中重新出现目标条带。

图12 重组GRSP 与方解石型以及文石型碳酸钙晶体结合后的SDS-PAGE 电泳结果Fig.12 In vitro adsorption of recombinant GRSP precipitated by CaCO3（calcite and aragonite）crystal

3 讨论

生物矿化是动物硬组织，包括贝类贝壳（碳酸钙）和脊椎动物骨骼（羟基磷灰石）等形成的主要机制，其过程受各种生物矿化蛋白的调控［20］。其中，贝类的贝壳基质蛋白在贝壳形成过程中对碳酸钙晶体有重要的调控作用。从蛋白质组学分析看，从一个物种中鉴定出的贝壳基质蛋白种类有数十种至数百种不等［11，21-23］，这一方面与蛋白质组学鉴定技术及相关仪器的灵敏度有关，另一方面也表明不同物种的贝壳，因其结构差异，在贝壳基质蛋白的分子组成上存在较大差异，同时也表明贝壳在形成时所涉及的分子机理极为复杂。目前，SMP 如何调控贝壳形成仍缺乏足够的依据，虽然数据库中已有上千种不同物种的贝壳基质蛋白序列，但其对碳酸钙晶体结晶的影响以及在贝壳形成中的作用机制仍了解不多。

作为一种含PDZ 结构域的贝壳基质蛋白，GRSP 已在双壳贝类贝壳，如贻贝、牡蛎、扇贝等中被检出［11，21，24-25］，表 明GRSP 可能是 一种普 遍存在于双壳贝类的贝壳基质蛋白。GRSP 无可预测的信号肽，表明该蛋白是一种胞内蛋白，但其通过何种途径运输至贝壳内部尚不得而知。但从以往的研究看，在所鉴定的贝壳基质蛋白中，带有信号肽序列的蛋白所占比例并不高，通常不到20%［11，21］。从现有研究看，贝壳基质蛋白分泌至贝壳具有多种转运途径，经典的信号肽转运途径只是其中之一，还有囊泡运输等［26-27］。因此，尽管GRSP 序列中无信号肽，但仍有可能通过其他途径被转运至贝壳内。GRSP 的氨基酸序列分析结果表明，GRSP 富含谷氨酰胺、脯氨酸和丝氨酸，其中谷氨酰胺的比例高达18.2%，此外，在序列部分区域形成“QQQP/YQ”重复序列且集中分布在其序列PDZ结构域和ZM 结构域之间（见图1）。上述低复杂度区域以及高丰度的谷氨酰胺残基可能与GRSP 的功能密切相关。贝壳基质蛋白通常富含某一种或某几种氨基酸，例如，从珠母贝（Pinctada fucata）贝壳中检测到的贝壳基质蛋白N16 富含甘氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺，阿司匹林（Aspein）富含天冬氨酸［28-29］，以及从三角帆蚌（Pinna nobilis）贝壳中检测到的黏蛋白（mucoperlin）富含丝氨酸和脯氨酸等［30］。高丰度的某种氨基酸往往会在序列中形成所谓的低复杂度区域（low complexity region）或重复片段。该区域因其结构柔性较大，而被认为有利于贝壳基质蛋白的转运，以及有利于与多种靶标分子（如钙离子或者碳酸钙晶体）结合［31-34］；另外，低复杂度区域以及重复片段被认为具备较好的进化灵活性，有利于贝壳基质蛋白的分子进化［35-36］。GRSP 在序列的185～286 肽段以及570～581 肽段，形成富含谷氨酰胺残基的低复杂度区域（见图1），推测该区域可能与其分子结构的柔性以及生物矿化功能有重要联系。

GRSP 序列中含有PDZ 结构域和ZM 结构域，并与PDLIM 蛋白具有一定的同源性。PDZ 结构域普遍存在于生物中，是一种涉及蛋白质-蛋白质相互作用的结构域［37-38］，该结构域参与了多种蛋白质复合物的形成，如膜相关蛋白、胞质信号蛋白、细胞骨架蛋白等［12，37-39］。而ZM 结构域较为短小（不超过30 个氨基酸残基），且通常伴随PDZ 结构域出现，主要发现于细胞骨架蛋白和肌肉蛋白中，作为一种Z带选择性剪切PDZ 结构域（Z-band alternatively spliced PDZ motif，ZASP）存在［39］。PDLIM 蛋白是一种典型的含PDZ 结构域和ZM 结构域的蛋白，也是一种模块化的涉及蛋白质相互作用的蛋白质［40］，其在进化过程中具有高度保守性，并在器官发育和维持以及组织形态发生过程中起关键作用［41］，PDLIM 蛋白具有多种功能，包括与肌动蛋白的结合，参与细胞骨架调控等［40-43］，此外，其还与生物矿化存在关联，可调控骨组织发育过程中骨骼的形成、分化和成熟［44］。考虑GRSP 与PDLIM 蛋白存在一定的序列相似性和结构域架构相似性（见图3），推测GRSP 可能对贝壳的形成有影响，通过蛋白序列中的PDZ/ZM 结构域与其他贝壳基质蛋白的相互作用调控贝壳形成。

重组厚壳贻贝GRSP 的功能分析结果表明，重组GRSP 对碳酸钙晶体的形貌和晶型影响较大，主要表现为文石型碳酸钙晶体的形貌发生改变（见图9）以及方解石型晶体的晶型出现文石型特征峰（见图10）。厚壳贻贝GRSP 主要鉴定自贝壳中的肌棱柱层［11］。肌棱柱层是贝壳负责与后闭壳肌相连的区域，其碳酸钙晶体主要为平行排列的文石型晶体，与同样是文石型的珍珠质层在形貌上差异较大［13，21］。表明同一种晶型的碳酸钙晶体在贝壳中可构成不同的微观形貌。推测GRSP 对碳酸钙晶体的形貌及晶型的影响，与其在肌棱柱层中特别是与文石型晶体在肌棱柱层的形成有关。此外，重组GRSP 对方解石型晶体的结晶速度具有抑制作用，但对文石型晶体的结晶速度有轻微促进作用（见图11）。贝壳基质蛋白在调控贝壳形成过程中，通常会通过与碳酸钙晶体的不同晶面结合抑制碳酸钙晶体结晶［45］，诱导碳酸钙晶体在不同晶面形成不同的结晶速度，最终形成不同形貌和晶型的碳酸钙晶体，从而组装成生物矿化组织的微观结构［46］。推测GRSP 也是通过类似作用对碳酸钙晶体的形貌和晶型产生影响，但重组GRSP 对文石型晶体的促进作用仍有待进一步研究。

4 结论

通过密码子优化结合原核重组表达技术，成功获得重组厚壳贻贝GRSP 蛋白。通过对该蛋白的序列分析和功能研究发现，作为一种贝壳基质蛋白，厚壳贻贝GRSP 可影响碳酸钙晶体的形貌和晶型，对碳酸钙晶体的结晶具有抑制作用，并具有与碳酸钙晶体结合的能力。该蛋白可能在厚壳贻贝贝壳的肌棱柱层形成过程中发挥重要功能，为探究贻贝贝壳的生物矿化机制以及基于GRSP 的后续研究奠定一定基础。

感谢浙江大学电镜中心宋丹丹老师在扫描电镜观察中的帮助。