良恶性甲状腺结节的分子鉴别诊断进展

叶 蕾，李浩榕

（上海交通大学医学院附属瑞金医院内分泌代谢科 上海市内分泌代谢病研究所上海市内分泌肿瘤重点实验室，上海 200025）

甲状腺结节在临床非常常见，采用触诊方式，其检出率即可达4%～8%，而采用高分辨率B 超检查则可在高达68%的人群中检出甲状腺结节。女性和老年人群的甲状腺结节患病率更高[1-2]，其中7%～15%为甲状腺癌[3-4]。甲状腺结节按其生物学行为可分为良性、交界性、恶性三大类。良性甲状腺结节包括结节性甲状腺肿、炎性结节、甲状腺囊肿、滤泡性腺瘤等；恶性甲状腺结节分为滤泡上皮来源和滤泡旁细胞来源，滤泡上皮来源又可根据其分化程度分为分化型甲状腺癌、低分化型甲状腺癌和未分化型甲状腺癌。其中，分化型甲状腺癌包括甲状腺乳头状癌（papillary carcinoma of thyroid,PTC）和滤泡状甲状腺癌 （follicular thyroid cancer,FTC）2 种亚型，PTC 是最常见的甲状腺恶性肿瘤。滤泡旁细胞来源的恶性结节即为甲状腺髓样癌，由于其分泌降钙素，可由血清检测检出，相对容易诊断。

甲状腺结节诊治的关键点是良恶性的鉴别。目前，术前鉴别甲状腺结节良恶性的金标准方法是在超声引导下细针穿刺抽吸活检（fine-needle aspiration biopsy，FNAB）联合细胞学检查。FNAB 检查已经使得甲状腺结节患者术前诊断出甲状腺癌的百分比有了显著提升[5]。在Bethesda 分级为Ⅵ类的结节中，甲状腺癌的百分比高达99%[6]，但目前也仍有约25%的甲状腺结节无法通过FNAB 检查来判断其良恶性，尤其是Bethesda 分级为Ⅲ～Ⅳ类的结节，即滤泡性腺瘤或可疑滤泡性腺瘤以及不确定分类的甲状腺结节，其中恶性结节占6%～34%。在这种情况下，患者如接受手术，则需承受手术风险以及终身甲状腺激素替代治疗，且其中75%的患者在术后被确诊为良性甲状腺结节；患者如选择采用超声及FNAB 检查进行随访，则需接受潜在的恶性肿瘤患病风险和心理负担。可见，避免甲状腺结节患者接受过度治疗的关键在于对Bethesda 分级为Ⅲ～Ⅳ类的结节进行术前诊断。近年，甲状腺结节的相关基因检测进展为甲状腺结节良恶性的定性提供了参考。

甲状腺结节相关基因的突变及重组

一、甲状腺癌相关基因的突变

体细胞基因变异是甲状腺癌发生的主要原因[7]，与恶性结节相关的基因变异主要涉及MAPK通路和PI3K 通路，常见的突变基因包括BRAF、RAS、AKT1、PIK3CA、PTEN、TP53 以及RET/PTC 和PAX8/PPARG 基因重组等。学者研究了肿瘤基因组图谱和中国人群PTC 基因图谱后发现，绝大多数PTC 患者的扳机基因发生了改变，其中最常见的是BRAF V600E 突变,有45%的经典型PTC 以及80%～100%的高细胞亚型PTC 患者存在该突变[8]；其他PTC常见的基因突变还包括RAS、EIF1AX 及RET/PTC基因重组等[7]。而FTC 常见的基因突变则有RAS、DICER1、PAX8/PPARG 基因重组等[9]。甲状腺未分化癌（anaplastic thyroid carcinoma,ATC）中，TERT 基因突变最为常见,出现频率为55.56%。74.07%的ATC 患者发生抑癌基因突变，其中TP53 频率最高，为48.15%[10]。甲状腺髓样癌的致病基因为RET，主要以点突变为主。除此之外，miRNA 表达异常、甲基化等表观遗传学异常也被证实与甲状腺癌的发生、发展密切相关。

二、良性甲状腺结节相关的基因突变

部分良性甲状腺结节也存在体细胞驱动基因变异。在甲状腺良性结节中，自主高功能性腺瘤与TSHR、GNAS、EZH1 基因突变有关[11]；腺瘤样结节与SPOP、EZH1 与ZNF148 这3 个基因突变有关。良性甲状腺结节与恶性甲状腺结节之间不仅具有不同的突变谱，两者的遗传进化也不相同[12]。值得注意的是，RAS 突变虽然在甲状腺良恶性结节中均有出现，但当合并不同其他基因突变时，研究者有不同的解读意义。

对各类甲状腺结节分子机制的深入研究为甲状腺结节的分子诊断提供了详实的依据。2015 年，美国甲状腺协会建议将分子诊断纳入良恶性甲状腺结节鉴别诊断的手段[12]。分子诊断能在FNAB检查的基础上，进一步提高恶性甲状腺结节术前诊断的准确率，尤其是可提高滤泡性腺瘤或可疑滤泡性腺瘤以及不确定分类的甲状腺结节的诊断准确率。

基于体细胞基因的分子诊断

一、单基因分子诊断

1.BRAF：BRAF 基因突变是诊断甲状腺癌价值最高的基因突变。良性甲状腺结节中几乎不存在BRAF 基因突变，而高达80%的PTC 中存在BRAF V600E 突变。荟萃分析显示，BRAF V600E 突变检测诊断PTC 的特异度和阳性预测值均高达100%[13]。在缺乏FNAB 检查提示的恶性证据时，BRAF V600E 突变强烈提示PTC 可能。除诊断价值外，BRAF V600E 突变可能还与PTC 患者的预后相关。多中心、大样本队列研究发现，存在BRAF V600E突变的PTC 患者死亡风险较无该突变的PTC 患者增加了2.66 倍，而其复发风险则增加了1.82 倍[14]。但也有研究不支持该结果，因此还需要进一步收集更多的研究数据来明确BRAF 单基因突变预测预后的价值。

2.RAS：RAS 突变虽然是FTC 最常见、PTC 第二常见的基因突变，但其在良性结节中也存在。因此，如果细胞学检查提示结节为良性，而患者存在RAS 单基因突变，建议以随访为主，但患者如果还合并有其他基因突变，特别是TERT 启动子区、EIF1AX 或TP53 突变时，则预示其为高侵袭性甲状腺癌的风险明显增高。

3.TERT：TERT 是具有预后价值的基因，尤其是与BRAF 突变同时存在时，提示患者预后不良。TERT 基因突变在ATC 中最为常见，出现频率为55.56%。BRAF 与TERT 双突变则预示PTC 患者的死亡风险将增加9.34 倍，复发风险增加8.51 倍[15]。因此，联合检测BRAF 和TERT 突变具有预后判断价值。

4.RET：RET 基因重组是PTC 的特征性突变之一，而RET 基因点突变是则甲状腺髓样癌的特征性突变。RET/PTC 基因重组在PTC 中的发生率为6.8%；约25%的甲状腺髓样癌患者携带胚系RET基因突变，临床可表现为多发性内分泌腺瘤病Ⅱ型，故胚系RET 基因突变检测对多发性内分泌腺瘤病Ⅱ型具有诊断价值，而75%的散发MIT 患者存在体细胞RET 基因突变。

总之，单基因的DNA 水平分子诊断成本低、操作方便、解读简单。然而，单个基因的诊断价值有限 （如RAS），或者预后判断价值有限 （如BRAF 或TERT），单个基因突变也不足以同时诊断各类型甲状腺结节，还存在样本量和诊断周期问题。因此，单基因检测已经不能满足临床诊断的需求。

二、多基因分子诊断

随着高通量测序技术的发展，针对体细胞基因突变的靶向第二代测序技术开始被应用于不确定分类的甲状腺结节FNAB 检查中。2011 年，匹兹堡大学病理系的Nikiforov 等[16]首次报道了7 个基因的联合突变检测，包括BRAF V600E、NRAS codon 61、HRAS codon 61 和KRAS codons 12/13 点突变，以及RET/PTC1、RET/PTC3、PAX8/PPAR 重组，使得阳性预测值达到95%。2013 年，ThyroSeq开始进入大家的视野[17]，第1 版包括了12 个基因（BRAF、NRAS、KRAS、HRAS、CTNNB1、PIK3CA、RET、PTEN、TSHR、AKT1、TP53 与GNAS）。3 年后，第1版本升级为ThyroSeq 第2 版[18]，增加了TERT 热点变异检测 （C228T、C250T） 和42 种融合基因检测（RET、PAX8 融合基因等）。前瞻性研究的数据表明，第2 版对于FNAB 检查分类为滤泡性腺瘤或可疑滤泡性腺瘤的诊断准确率达到92%[19]。2018 年ThyroSeq 第3 版发布，增加至112 个基因，除点突变及融合基因之外，其还纳入拷贝数变异和基因表达异常。该第3 版基于多基因的 “基因分类器（genomic classifier）” 诊断甲状腺癌的灵敏度达到98.0%，特异度达81.8%，准确率达到90.9%[20]。之后，美国和加拿大的2 项前瞻性研究均证实其具有高效的诊断价值。美国的多中心、双盲前瞻性研究纳入了286 例FNAB 检查结果不明确的甲状腺结节患者，结果显示，ThyroSeq 第3 版诊断甲状腺癌的灵敏度为94%，特异度为82%，良性报告率为61%，在报告为良性的甲状腺结节中，仅有3% 恶性风险[21]，这与FNAB 检查结果为良性的恶性风险一致。加拿大的单中心研究纳入了50 例FNAB 检查结果不明确的病例，结果显示，ThyroSeq 第3 版的良性报告率为58%，其评估为阳性的24 例样本，术后病理均为恶性；检测结果为阴性的26 例患者中有3 例行手术，术后病理检查提示仅1 例为恶性[22]。

基于RNA 和miRNA 表达的分子诊断

一、基于RNA 的分子诊断

过去，基于RNA 表达的分子诊断，其最大瓶颈是灵敏度不足。直到2010 年，来自Veracyte 公司的Kennedy 博士团队运用FNAB 检查结果的基因表达谱数据进行分析，在纳入100 余个在良恶性结节间差异表达的基因之后，初步发现基因表达谱分析诊断甲状腺癌的灵敏度达到95%，特异度为75%。2012 年，新英格兰医学杂志发表了多中心、前瞻性研究结果，研究者在之前研究的基础上，选择了167 个基因，建立了Afirma Gene Expression Classifier （Afirma GEC）表达谱芯片，发现Afirma GEC 诊断甲状腺滤泡性腺瘤或可疑滤泡性腺瘤的阴性预测值达到96%，灵敏度高达92%，但特异度仅为52%[24]。2018 年，在Afirma GEC 的基础上，学者采用第二代测序技术构建了Genomic Sequencing Classifier（GSC），其纳入了1 115 个核心基因进行综合分析，GSC 在阴性预测值维持在96%的情况下，可将特异度提高至91%[25]。

有研究对Afirma GEC、GSC 与ThyroSeq 系列的诊断效能进行了比较分析。2018 年，一项平行随机对照研究直接比较了Afirma GEC 与ThyroSeq第2 版在Bethesda Ⅲ、Bethesda Ⅳ结节中的诊断效能[26]，结果发现，ThyroSeq 第2 版的诊断特异度更高（66%比91%），其可以让更多的受试者避免诊断性手术，两者的阳性预测值则分别为39%和57%。39%接受Afirma GEC 检测的患者避免了诊断性甲状腺腺叶切除，而62%接受ThyroSeq 第2 版检测的患者避免了手术。

二、基于miRNAs 的分子诊断

业内对基于miRNAs 的分子诊断，认可度相对较低。早在2008 年，研究发现，相对于良性甲状腺结节，甲状腺癌组织具有特异的miRNA 表达谱，且病理类型不同，miRNA 表达谱也不同。甲状腺髓样癌与滤泡细胞来源的甲状腺癌miRNA 表达谱完全不同。miR-187、miR-221、miR-222、miR-181b、miR-146b、miR-155、miR-224 在滤泡细胞来源的甲状腺癌中均一致高表达。而在ATC 中，这7 个miRNA表达的水平较低，但miR-302c、miR-205、miR-137会有显著的高表达。该研究提示，检测miRNA 异常表达可能也可以作为甲状腺癌的分子诊断方法[27]。2018 年，基于19 种miRNAs 表达的panel （包含miR-221、miR-222 和miR-146b 等）发表，结果证实其能够从FNAB 检查结果不确定的甲状腺结节中准确鉴别出分化良好的甲状腺癌，其诊断特异度和阳性预测值均为100%，阴性预测值为87%，灵敏度为91%，总体准确率达到了94%[28]。

不同分子诊断平台的比较及分子诊断的局限性

一、不同分子诊断平台

上述几种分子诊断共同的优势在于阴性预测价值较高，因此主要临床用途为避免不必要的手术，但阳性预测值尚待进一步提升，尤其是Afirma GEC、GSC 平台。ThyroSeq，尤其是第3 版本综合了DNA 和RNA 检查，使得阳性预测值在Bethesda Ⅲ类结节中达到77%，Ⅳ类结节中达到83%。但这需要同时获取FNAB 的DNA 和RNA 样本，分别建库测序，因此检测成本也大幅提高。目前，以上几类平台均未进入中国，因而其在我国甲状腺结节患者中的诊断价值尚未被确认。目前，国内有多个企业自主研发的甲状腺癌基因检测panel，但纳入基因数量普遍偏少，缺少大样本的人群数据证实其诊断价值。

二、分子诊断的局限性

虽然分子诊断为甲状腺良恶性结节的术前诊断提供了有效的工具，但是存在取材失败、费用昂贵、缺失有效信息的风险分层标志物等方面的问题，极大限制了其被广泛应用。比如取材问题，虽然甲状腺因其独特的解剖学位置，医师能通过细针穿刺获取组织，但FNAB 穿刺样本仍有其特殊性，约1%的穿刺样本中滤泡细胞数量太少，无法获得可靠的分子诊断数据。此外，标本中携带阳性突变肿瘤细胞的百分比也会直接影响阳性位点的检出。昂贵的检测成本也是一个重要的问题，虽然测序成本日益下降，然而这些商业检测方案的价格仍旧很昂贵。在我国，医疗手术费用远低于西方国家，因此当分子检测成本接近手术费用时，更多的患者和医务人员会直接选择手术。最后，目前缺乏提示甲状腺癌风险分层的分子事件，不能有效指导手术治疗的范围和随访管理方案。

前景及展望

精准医学包括精准诊断和精准治疗，是现代医学的发展趋势。因此，甲状腺结节的分子诊断也是大势所趋。目前，真实世界数据已经证实分子诊断可以避免相当数量的甲状腺结节患者接受不必要的手术。未来希望分子检测能够进一步降低成本，并在甲状腺癌风险分层方面提供更多的临床帮助，实现分子诊断预测甲状腺结节患者预后的价值。