美拉德反应产物中三类官能团化合物的质量分布与主体香气特征

朱龙杰,曹 毅,朱怀远,吴 洋,张合川,陈晶波,王 瑞,张 华,张 媛,廖惠云

(江苏中烟工业有限责任公司技术中心,江苏南京 210019)

美拉德反应是含游离氨基的化合物与还原糖或羰基化合物在常温或加热时发生的聚合、缩合等反应,最终生成棕黑色的大分子物质类黑精的一类羰胺反应[1-3]。除产生类黑精外,反应还会生成还原酮、醛和杂环化合物,其中有些物质是食品色泽和风味的主要来源,还有些物质具有独特的抗氧化性物质[4-7]。因此,美拉德反应产物成为研究的热点,在食品烘焙[8-9]、酿酒[10]、肉类加工[11-12]、香精生产[13-15]、烟草加香[16]、医药[17-19]等领域应用广泛。

关于美拉德反应产物的分析研究,目前集中于反应条件的优化及美拉德反应产物分析与应用[20-26],多数研究会选择各自的美拉德反应体系,以及选择少数几种糖和少数几种氨基酸制备美拉德反应产物[18-19,27-29]。但由于不同反应体系下的美拉德反应产物主要组分的质量分数存在差异,且香气浓度和风味特征也经常产生变化,因此很难根据文献资料对不同反应体系下的美拉德反应产物的相关组分进行整体类比推导,也很难对美拉德反应产物的香气浓度和香气特征进行准确评价。

目前,关于美拉德反应产物的化学组分研究,一般是对反应产物中检出的所有成分进行定性或定量分析[18-21,23-27]。这通常适用于一种或几种美拉德反应产物的研究分析,但如果要对多种糖和多种氨基酸制备的不同美拉德反应产物进行分析,就会使得工作量十分巨大。同时,这种研究方法还缺少侧重性,即美拉德产物中的成分非常复杂,很多检测出的有机物尽管含量较大,但香气却较弱,如某些小分子的烷烃、醇、醚、酸等物质,对美拉德反应产物的主体香气特征贡献较少,因此需要选择具有较强风味特征和较低香气阈值的关键组分进行重点研究分析。

美拉德反应中存在的芳香族类、杂环类和烯酮(醛)类三大类化合物,风味特征明显,其气味强度高和香味阈值低,是具有典型香气特征的化合物[30-31]。从天然产物中提取的许多芳香族类物质很多都会产出不同的香味特征,在某些氨基酸美拉德产物中,特别是含有苯环的氨基酸的美拉德反应产物中具有很多芳香族类化合物,为美拉德产物提供不同的香气来源[31]。杂环类化合物的分子中拥有与苯环类似的不饱和的闭环共轭体系,也具有不同程度的芳香性,大多数杂环化合物有极高的气味强度和极低的香味阈值,因此杂环化合物是美拉德产物的重要致香成分[32]。烯酮类化合物分子中有不饱和双键,根据电子振动理论,其易受氧化还原酶作用,使人体嗅神经末梢细胞产生嗅觉[33]。由于烯酮(醛)同时具有不饱和碳碳和碳氧双键,因此烯醛(酮)类化合物气味阈值低,香气更加突出。

本工作拟探讨在一个合适的反应体系下,制备多种糖类和多种氨基酸的美拉德反应产物,选择美拉德反应产物中杂环类化合物、芳香族类化合物和烯醛(酮)类三类官能团化合物的进行定性定量分析,获取这三类关键组分的质量分布规律,并结合美拉德反应产物主体香气特征的感官评价,准确地解析美拉德反应产物的主体香气特征,为其在食品、香料等行业的应用体现出更好的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

D-葡萄糖、D-果糖、D-木糖、D-脱氧核糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、L-甘氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-谷酰胺、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-半胱氨酸 BR,国药集团化学试剂有限公司;碳酸钾、无水硫酸钠、丙二醇 AR,国药集团化学试剂有限公司;丙酸苯乙酯 >97%,阿法埃莎化学有限公司;超纯水 电阻率≥18.2 MΩ·cm。

ME203电子天平 感量0.001 g,瑞士Mettler Toledo公司;S210型pH计 分辨率0.001,瑞士Mettler Toledo公司;ZNCL-G型智能恒温磁力搅拌器 河南爱博特科技发展有限公司;R215型旋转蒸发仪 瑞士Buchi公司;6890N-5975C型气相-质谱联用仪 美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 美拉德反应体系的优化 丙二醇是一种与水互溶、性质稳定且对环境友好的有机溶剂,在美拉德反应中常用来控制反应体系中水分的比例[14,23]。由于本实验温度选择在100 ℃,以及丙二醇与水组成的混合溶剂具有较高的恒沸点,因此选择丙二醇作为美拉德反应的主要溶剂。

为解决美拉德反应进程中的酸化现象比较严重的问题[34-35]和五碳糖、六碳糖的原料代表性问题,根据前期研究结果,本实验使用碳酸钾维持美拉德反应体系的pH为碱性,以葡萄糖、果糖、木糖和脱氧核糖四种非互为光学异构体的单糖作为美拉德反应的糖类原料,将其分别与20种不同氨基酸原料进行两两组合反应,共计制备80种美拉德反应产物。

1.2.2 美拉德反应产物的制备 在50 mL的圆底烧瓶中加入5 mmol糖和5 mmol氨基酸,根据氨基酸的类型加入适量碳酸钾(原料为天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和酪氨酸时,碳酸钾的添加量为5 mmol;其他氨基酸时,碳酸钾的添加量为2.5 mmol),维持反应液的pH为碱性。反应溶液为20 mL丙二醇和5 mL超纯水,升温加热至100 ℃,反应时间为6 h。

1.2.3 美拉德反应产物中三类官能团化合物的检测 取2 mL美拉德反应液加入含有分液漏斗中,加入含有内标丙酸苯乙酯的二氯甲烷溶液,使用二氯甲烷与水相体系进行振荡萃取。有机相经分离、无水硫酸钠干燥、漏斗过滤、旋转蒸发浓缩后,采用GC/MS进行检测分析。

气相色谱条件:色谱柱 Agilent DB-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm);载气He;载气流速1.0 mL/min;进样口温度260 ℃;进样量1 μL,分流比为10∶1;升温程序:60 ℃ 保持1 min,以10 ℃/min升温至280 ℃,保持15 min。

质谱条件:电离方式EI;电离能量70 eV;离子源温度230 ℃;四级杆温度150 ℃;质量扫描范围30～450 amu;溶剂延迟3 min。

1.2.4 美拉德反应产物的主体香气特征描述与感官质量评分 取0.5 mL美拉德反应液溶于5.0 mL乙醇溶剂中,将其存放在10 mL棕色玻璃瓶中,摇匀以备使用。用标准嗅香纸(长140～150 mm,宽5～6 mm),不带其他气味。将嗅香纸浸入样品1～2 cm深,离鼻腔2.5 cm通过鼻孔吸气,每次2～3 s。评香应在一定间隔时间内进行,蘸后即嗅。记录每个美拉德反应产物的香气特征,用生活中常见的类似物质风味特征作一般性描述词语,其中描述型词语参考香料评价时常用的修饰词语[28-31]。

表1 天冬酰胺-果糖美拉德反应产物中官能团化合物种类和质量

根据美拉德反应产物主体香气的令人愉悦程度和香气强度两项对其整体感官质量进行评分。在主体香气感官质量得分中,令人愉悦程度占0～5分,香气强度为0～5分,满分10分。当香气令人愉悦程度为0分时,即香气表现出不令人愉悦时,香气强度不参与评分,该香味物质整体感官质量为0分。

1.3 数据处理

采用GC/MS工作站自带的Nist 14和Wiley标准质谱图库检索美拉德反应产物中各化合物质谱数据,结合化合物的质谱离子裂解规律和保留时间,对能予以定性(匹配度大于850和可能性大于80%)且属于三类官能团化合物的组分进行探讨。以内标丙酸苯乙酯为基准物质,采用半定量方法设定相关参数[23],利用峰面积归一化法计算各化合物的相对质量。通过公式(1)计算单一目标化合物的质量,通过公式(2)计算美拉德反应产物中三类官能团化合物的总质量。上述数据均使用Excel 2010数据处理软件进行计算。

Mi=Ms×Ai/As

式(1)

MT=12.5×ΣMi

式(2)

式中:Mi:i组分的质量;Ms:内标物的质量;Ai:i组分的峰面积;As:内标物的峰面积;MT:美拉德反应产物中三类官能团化合物总质量。

2 结果与分析

2.1 美拉德反应产物中三类官能团化合物的种类分布

以天冬酰胺-果糖美拉德反应产物为例,采用1.2.3的方法对该美拉德反应产物进行GC/MS分析,得到了天冬酰胺-果糖美拉德反应产物总离子流图,见图1。

图1 天冬酰胺-果糖美拉德反应产物总离子流图

对图1色谱图中的各色谱峰进行质谱解析及标准谱库检索定性,并计算得到天冬酰胺-果糖美拉德反应产物中属于三类官能团化合物的物质名称与质量,参见表1。表1结果显示,天冬酰胺-果糖美拉德反应产物中共鉴定出20种杂环类官能团化合物,主要为含氮化杂环化合物,包括占主要部分的17种吡嗪化合物以及3种吡啶类化合物。

依次对制备的其他美拉德反应产物中的各组分进行标准谱库对比和质谱辅助解析,鉴定出属于杂环类、芳香族类、烯酮(醛)类三大类官能团化合物的香味物质共有64种。对鉴定出的64种香味组分进行汇总,根据每种化合物的分子骨架结构特点,归纳出美拉德反应产物中三类官能化合物的分子骨架图,见图2。图2中Y基团为三类官能化合物分子骨架中某一(几)点位上的不同取代基,当化合物的分子骨架与不同Y基团组合后,即为美拉德反应产物中已鉴定出的目标化合物。

图2 美拉德反应产物中三类官能团化合物的分子骨架图

2.2 美拉德反应产物中三类官能团化合物的质量分布情况和香气特点

依据2.1中天冬酰胺-果糖美拉德反应产物中三类官能团化合物的种类鉴定和质量计算方法,对制备的80种美拉德反应产物进行种类鉴别和质量计算,得到美拉德反应产物中三类官能团化合物的质量与总质量分布表,其中杂环类化合物质量包括氮杂环化物、氧杂环化合物和硫杂环化合物的质量,详情见表2～表5。

表2 葡萄糖与氨基酸美拉德反应产物中三类官能团化合物的质量分布

表3 果糖与多种氨基酸美拉德反应产物中三类官能团化合物质量分布

表4 木糖与多种氨基酸美拉德反应产物中三类官能团化合物质量分布

表5 脱氧核糖与多种氨基酸美拉德反应产物中三类官能团化合物质量分布

表2～表5数据显示,四种糖类美拉德反应产物中,含氮杂环类化合物在所有制备的美拉德反应产物中都有分布,且整体质量分数较高,在美拉德反应产物三类官能团化合物中占有很大比重。鉴定出的含氮杂环化合物中以吡嗪类化合物居多,其他还有一些吡啶类和吡唑类含氮杂环化合物(分子结构参见图2A1)。在制备的含氮杂环化合物质量分数高的美拉德反应产物中,大部分产物香气丰富、令人愉悦,拥有比较突出的坚果香、可可香、玉米香、烤土豆香、烘烤香等,代表性的化合物有2,5-二甲基吡嗪、2-乙酰基吡嗪、2-乙酰基吡啶等。

含氧杂环化合物在六碳糖葡萄糖和果糖中略有分布,而在五碳糖木糖和脱氧核糖中比较少(分子结构参见图2A2)。含氧杂环化合物一般拥有甜香、焦糖香,枫槭香、奶油香等的香气特征[31,33],代表性的化合物有甲基环戊烯酮醇、3,5-二羟基-6-甲基-2H-吡喃-4(3H)-酮、4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮等。在制备的含氧杂环化合物的美拉德反应产物中,大部分产物都能辨别出具有的特征甜糖香气,其中葡萄糖美拉德反应产物的甜香要比果糖美拉德反应产物更容易辨认。通过对比表2和表3,分析这可能是因为葡萄糖美拉德反应产物中氧杂环化合物的质量要明显多于果糖美拉德反应产物中氧杂环化合物的质量。

含硫杂环化合物只存在一些特定的含硫氨基酸美拉德反应产物中。尽管蛋氨酸美拉德反应产物的三类官能团化合物总质量要整体高于半胱氨酸美拉德反应产物,但是蛋氨酸美拉德反应产物中并没有检测出含硫杂环化合物。相反,三类官能团化合物总质量较少的半胱氨酸美拉德反应产物中却检测出了噻唑类含硫杂环化合物(分子结构参见图2A3)。由于蛋氨酸中的硫原子只生成开链式的含硫化合物,使得该美拉德反应产物有明显让人不太愉悦的硫化物气味。而半胱氨酸的美拉德反应产物由于生成了闭环的含硫杂环化合物,其香气令人愉快、扩散好、穿透性强,具有烤面包香、爆玉米花、熟蛋香等香味特征,主要代表化合物为2-乙酰基噻唑。

芳香族类化合物主要存在于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸美拉德反应产物中。其中苯丙氨酸和酪氨酸的美拉德反应产物中小分子的含有苯环的化合物质量分数较为丰富(分子结构参见图2B),这些芳香族类化合物使得美拉德反应产物透发出比较明显的花香和辛香,代表性的化合物有苯乙醇、苯乙醛、苯乙酸乙酯等。而色氨酸美拉德反应产物中大分子类芳香族类化合物质量分数较高(分子结构参见图2B),但该芳香族类化合物种类较为单一,含有苦杏仁气味,香气扩散能力一般,香气不够飘逸,主要代表性的化合物为2-氨基苊-1(2H)-酮。

烯酮(醛)类化合物主要分布在亮氨酸和异亮氨酸两种氨基酸美拉德反应产物中。其中在亮氨酸和异亮氨酸美拉德反应产物中主要是开链式的烯酮(醛)类化合物(分子结构参见图2C),其质量分数较丰富,整体香气也较浓郁,散发出独特的药草香、苔香、霉香等香气,代表性的化合物有(E)-5-甲基-3-烯-2-庚酮、(Z)-2-乙基-2-烯-己醛和(E)-2-异丙基-5-甲基-2-烯-己醛。另一类烯酮(醛)类化合物以五元闭环形式存在于其他一些氨基酸美拉德反应产物中(分子结构参见图2C),如蛋氨酸、精氨酸等,其特点是质量分数少,造成香气不够突出。

2.3 美拉德反应产物的主体香气特征

组织专业从事香精香料调配人员,对制备的80种美拉德反应产物进行香气感官评价。选种一种或几种常见香味物质香气作一般性描述词语,对所有美拉德样品进行香气感官评价,描述美拉德反应产物的香气特征,评价结果见表6。

表6 四种糖类与多种氨基酸美拉德反应产物的香气特征

由表6可知,糖类对美拉德反应产物的香气类型改变不大,而氨基酸种类则对美拉德反应产物的整体香气产生比较大的影响。不同氨基酸的美拉德反应产物香气特征种类较多,有些氨基酸美拉德反应产物的香气类型比较相似,而有些则差异较大。在众多香气类型中,甜香和坚果香是美拉德反应产物中两类重要的香气类型。甜香香型在美拉德反应产物中分布较多,不同糖类美拉德反应产物的香气大都带有一定的甜香特征,但甜香种类有所区别,其中葡萄糖美拉德反应产物带有甜糖香韵,果糖美拉德反应产物带有烤甜香韵,木糖美拉德反应产物带有清甜香韵,脱氧核糖美拉德反应产物带有弱甜香韵,其代表性美拉德反应产物有:甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、谷氨酸和酪氨酸美拉德反应产物。坚果香是美拉德反应产物中吡嗪类含氮杂环化合物的代表香味特征,当该类化合物质量分数高时坚果香气会比较突出,其代表性美拉德反应产物有:天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷酰胺、赖氨酸、组氨酸美拉德反应产物。其余不同氨基酸美拉德反应产物的香气特征区别较大,各自拥有专属的香味类型,如药草香、膏香、谷物香、花香、爆米花香、烟熏香等。

2.4 美拉德反应产物中三类官能团化合物质量和主体香气感官评分

根据香味评审员对制备的80种美拉德反应产物的主体香气感官评分,与美拉德反应产物中三类官能团化合物的总质量,从整体上评估两者的关联度,结果见表7。

从表7的 4种糖类的美拉德反应产物的横向对比中看出,果糖的美拉德反应产物中三类官能团化合物总质量高于其他糖类的美拉德反应产物,其主体香气评分对应的也普遍较高,大部分得分处于6～10分区间。而脱氧核糖的美拉德反应产物中三类官能团化合物总质量较小,其主体香气评分也较小,大部分得分处于1～5分区间。从表7的不同氨基酸美拉德反应产物的纵向对比中看出,亮氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸美拉德反应产物中的三类官能团化合物总质量处于较高水平,其相应的主体香气评分也较高,得分集中于7～9分区间。而丝氨酸、苏氨酸、精氨酸等其他氨基酸,由于三类官能团化合物总质量较低使得其主体香气得分也低,得分集中于2～4分区间。表7还显示,美拉德反应产物中三类官能团化合物的累计总质量大小关系为果糖>木糖>葡萄糖>脱氧核糖,而其主体香气的累计得分大小关系依次为果糖>葡萄糖>木糖>脱氧核糖。表7的数据表明,美拉德反应产物中三类官能团化合物的单项总质量和累计总质量与主体香气评价得分有较好的关联度。

从表7中可以发现,尽管大部分美拉德反应产物的三类官能团化合物总质量与其主体香气评分的关联度较好。但是含硫氨基酸美拉德反应产物较为特殊,其香气的主体特征由含硫化合物的种类决定。当美拉德反应中的硫原子没有形成杂环化合物的时候,具有不令人愉悦的含硫气味,如蛋氨酸美拉德反应产物,虽然其三类官能团化合物总质量较为丰富,但由于产物中含有开链式含硫化合物而透发出咸菜味和硫化物气息,主体香气不令人愉悦,香气评分为0分。

表7 美拉德反应产物中三类官能团化合物总质量与主体香气评分

但当美拉德反应中的硫原子形成闭环含硫杂环化合物的时候,其反应产物则具有令人愉悦的烤坚果,爆米花气味,评分则较高。例如,果糖-半胱氨酸美拉德反应产物,其三类官能团化合物总质量虽然很少,但由于生成香气阈值很低的闭环含硫杂环化合物,其香气具有很强的扩散性和穿透性,主体香气令人愉悦,香气评分达到了10分。

3 结论

通过对制备的美拉德反应产物的定性和定量分析,获得了杂环类、芳香族类和烯酮(醛)类三大类官能团化合物的种类与结构特点,以及三大类官能团化合物的质量分布规律。杂环类化合物尤其是含氮杂环类化合物种类多,质量分数较高,是美拉德反应产物中最重要主体香气来源。芳香族类和烯酮(醛)类化合物种类不多,质量分数较少,主要分布于几种特定的美拉德反应产物中,其主体香气具有各自的特点。

美拉德反应产物中三类官能团化合物的总质量与主体香气评分具有较好的关联度。不同糖类美拉德反应产物中三类官能团化合物累计总质量的顺序依次为果糖、木糖、葡萄糖和脱氧核糖,其主体香气的累计评分顺序依次为果糖、葡萄糖、木糖、脱氧核糖。不同氨基酸美拉德反应产物中三类官能团化合物总质量较高且主体香气评分较高的有亮氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸美拉德反应产物。含硫氨基酸美拉德反应产物比较独特,其主体香气评分与产物中含硫化合物的分子结构形态密切相关。

以美拉德反应产物中三类重要的官能团化合物作为研究对象,获得其质量分布规律和美拉德反应产物的主体香气特征,为香精香料和食品加工从业人员更好地应用美拉德反应产物提供了一个有用的技术支撑。