远志皂苷对脂多糖诱导的帕金森病模型大鼠的作用及机制研究

袁惠莉 宫晓丽 范 征 梁志刚 王晓民,6*

(1.北京卫生职业学院思想政治教学部，北京 101101；2.首都医科大学基础医学院生理学与病理生理学系，北京 100069；3.首都医科大学教育部神经变性病重点实验室，北京 100069；4.首都医科大学基础医学院药理学系，北京 100069；5.青岛大学附属烟台毓璜顶医院神经内科，山东烟台 264000；6.首都医科大学北京脑重大疾病研究院，北京 100069)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是1817年英国医生James Parkinson发现的多发于中老年人的中枢神经系统退行性疾病，主要病理改变是黑质致密区(substantia nigra pars compacta,SNpc)多巴胺(dopamine,DA)能神经元变性、死亡，残存神经元胞质内嗜酸性包涵体即路易小体(Lewy’s body,LB)形成，纹状体中DA含量减少[1]。患者典型的临床症状为震颤、肌僵直和运动迟缓等。随着社会老龄化进程的加快，PD的发病率逐年上升，给患者、家庭和社会带来沉重负担，日益成为突出的社会问题。

PD的病因和发病机制至今仍未阐明，目前认为是多种因素综合作用的结果。在PD患者及所有PD动物模型脑内均可见SNpc区DA能神经元丢失伴随过度的小胶质细胞活化，并且这种病理变化发生在PD早期并持续整个病程，表明小胶质细胞功能异常与PD的发生和发展密切相关。小胶质细胞作为中枢神经系统重要的免疫细胞，在受到感染、毒物等因素刺激后会释放大量促炎因子，如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-1,-6家族成员、IL-1、IL-6和前列腺素等，引发炎性反应。这些神经毒性物质与DA神经元表面的相应受体结合后，通过细胞内的信号转导通路，最终导致神经元的变性坏死。提示抑制小胶质细胞的激活及其引发的炎性反应，很可能对PD的预防及治疗起到积极作用。

远志(radix polygalae)是远志科植物远志和卵叶远志的干燥根，性温，味苦、辛，《神农本草经》记载其具有安神、益智、祛痰、消肿的功能。远志的活性成分有很多，包括皂苷类、黄酮类、寡糖酯类、生物碱等，其中远志皂苷(Tenuigenin，TEN)是从远志根中分离得到的五环三萜类化合物，是远志的主要活性成分，具有抗痴呆、抗衰老、抗感染、抗氧化等药理作用[2-8]。TEN可以促进淀粉样前体蛋白的降解，改善阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)动物模型的认知和行为。无论是动物实验还是细胞实验均显示[9-12]TEN可以通过抑制氧化应激和炎性反应，改善脑内单胺类神经递质的含量，增加神经营养因子的释放等途径，发挥神经保护作用。本研究旨在通过建立细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的PD炎症性大鼠模型，探讨TEN是否通过其抗感染活性发挥了对DA能神经元的保护作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠50只，体质量240～260 g，由维通利华实验动物技术有限公司提供,实验动物许可证号:SYXK(京)2018-0003。每笼5只群养，笼底铺以锯末，12 h/12 h昼夜循环照明，自由饮水和饮食。实验开始前适应环境一周。本实验所有操作均符合《中华人民共和国动物保护法》，通过了首都医科大学动物伦理委员会的批准。

1.2 主要药品

TEN由北京师范大学认知神经科学与学习国家重点实验室张占军教授提供，系采用远志科植物远志(Polygala Tenuifolia Willd)干燥根提取物，化学结构详见图1，分子式为C30H45ClO6，平均相对分子质量为537 140。

图1 远志皂苷的分子结构式Fig.1 Chemical structure of Tenuigenin

1.3 PD模型制备及分组

单侧黑质内注射脂多糖(lipopolysacharide,LPS)(美国Sigma公司)制备炎症PD大鼠模型。向大鼠右侧黑质内注射2μL(10 μg) LPS，建立炎症性PD大鼠模型，同时设立黑质内注射2 μL磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)的对照组。腹腔注射350 mg/kg水合氯醛(北京中国医药公司)麻醉动物。实验设立对照组、LPS模型组、TEN低浓度处理组(200 mg/kg)、TEN高浓度处理组(300 mg/kg)、阿司匹林(aspirin,ASP,32 mg/kg)处理组，每组10只大鼠。各组动物适应环境1周后，于手术前2周开始以灌胃形式给予0.9%(质量分数)氯化钠注射液及不同浓度的药物，1次/d，共14周。术后第7 周和第11周用转棒实验检测大鼠的运动协调能力，第12周用旷场实验检测大鼠自主运动能力，并于24 h内处死动物。其中每组区组随机法取4只，用4%(质量分数)多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)灌流固定，用于酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫组织化学染色，检测黑质DA能神经元的存活率；其余动物先心脏取血，然后断头处死，取双侧黑质，用于ELISA法检测血浆及黑质中TNF-α和IL-1β的浓度，同时取主要脏器进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色，观察TEN对主要脏器的影响。详见图2。

图2 实验流程图Fig.2 Experimental designPD:Parkinson’s disease;TEN:Tenuigenin;PBS:phosphate-buffered saline;LPS:lipopolysaccharide；TH：tyrosin hydroxylase;IL-1β:interleukin-1β;TNF-α:tumor necrosis factor-α;ASP:aspirin.

1.4 行为学测试

采用Accuscan 2.11 system大鼠自主活动监测系统记录大鼠的自主活动。每箱一只，测试前适应环境10 min，设定测试时间为30 min，行为测试仪统一记录，注意保持测试环境安静。测试完毕后用配套软件对运动次数、活动时间、休息时间、活动距离等运动指标进行计算、统计和分析。

转棒行为测试，造模前2周对大鼠进行转棒行为训练，并测试大鼠的转棒行为，每只测试3次，以在转棒上停留时间最长一次为准记录数据，以后在造模后第7周和第11周各进行一次转棒测试，每只测试3次，以在转棒上停留时间最长一次为准记录数据。

1.5 ELISA法检测黑质及血浆中TNF-α和IL-1β浓度

大鼠断头处死后，剥离脑，切取中脑，以中脑导水管的横断面为界，切除背侧脑组织，分离双侧黑质，在液氮中速冻，置于-80 ℃冰箱保存。将样品置于2 mL Eppendorf管中，加入冷冻的组织裂解液200～300 μL，冰浴中超声匀浆(0.5 Hz，即振动1 s，间歇1 s，反复4～5次)，4 ℃ 15 000 r/min离心15 min，取上清150 μL分装于1.5 mL Eppendorf管，-80 ℃冰箱保存，用于测定细胞因子及蛋白定量。用1 mg/mL标准牛血清白蛋白溶液，校准蛋白质检测仪。样品测定时，先将样品稀释40～80倍，然后取50 μL比色测定。按照ELISA试剂盒(上海 ExCell Biology公司)说明书的操作步骤进行，测定黑质中TNF-α和IL-1β的浓度。

将新鲜的大鼠血液收集在无热源、无内毒素的采血管中，采血管提前用抗凝剂乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)处理，1 000 g离心10 min，将上层黄色半透明液体移入新的1.5 mL Eppendorf管中，4 ℃保存待检测。24 h内按照ELISA试剂盒说明书的操作步骤进行，测定血浆中TNF-α和IL-1β的浓度。

1.6 TH免疫组织化学染色检测黑质DA能神经元的存活率

每组取4只大鼠经心脏灌流取材。腹腔注射1 mL 17.5%(质量分数)的水合氯醛深麻醉，剖开胸腔暴露心脏。经左心主动脉灌流100 mL 37 ℃的0.9%(质量分数)氯化钠注射液，随后灌流200 mL冰冷的4%(质量分数) PFA。打开颅骨取出全脑并切取中脑部分，置于4%(质量分数) PFA 4 ℃固定12 h，并用20%和30%(质量分数)的蔗糖溶液梯度沉淀。自蔗糖溶液中取出组织块，OCT包埋，然后投入-60 ℃的正己烷中骤冷35 s，用Leica冰冻切片机进行中脑切片，厚度为35 μm，共留取切片30张。切片贴在三乙氧基硅烷(3-aminopropyl-triethoxysilane,APES)处理过的载玻片上，冷风吹干，-20 ℃保存。其中第1、5、10、15、20和25张组织切片进行TH免疫组织化学染色。经TH免疫组织化学染色后，每只动物取2张切片，进行黑质致密部TH阳性细胞的计数，并计算每只动物左侧和右侧阳性细胞数的比值。此过程为双盲进行。

1.7 大鼠主要脏器形态检测

在PBS组、LPS组、LPS+TEN 200 mg/kg组和LPS+TEN 300 mg/kg组，随机选取5只动物，断头处死后快速分离心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺脏，置甲醛固定后，石蜡包埋，切片后进行HE染色，光学显微镜观察形态学改变。组织器官切片苏木精-伊红染色方法(HE染色)：配制苏木素染液，无水乙醇100 mL、甘油100 mL、苏木精2 g、钾明矾2 g、醋酸5～10 mL，置于阳光下自然氧化3个月左右成熟。配制伊红染液，伊红 0.5 g溶解于100 mL的80%(体积分数)乙醇。按照HE染色步骤,依次取材组织块，固定后石蜡包埋，做7 μm切片，用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，苏木素染色5 min，自来水冲洗；盐酸乙醇分化30 s，自来水浸泡15 min或温水(约50 ℃)5 min，置伊红染液2 min，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，普通光学显微镜下观察结果，大恒图像采集软件拍照。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 TEN改善PD模型大鼠的行为

转棒实验中，用造模前转棒持续时间，减去造模后转棒持续时间，数值差距越少则代表损伤越小。图3显示，造模后11周时，TEN低剂量组、TEN高剂量组及ASP药物组大鼠棒上停留时间差值较模型组明显减少，分别达模型组的25%、35%和34%，且差异有统计学意义。

图3 TEN对PD模型大鼠运动协调能力的影响Fig.3 Effects of TEN on the rotarod trial of PD ratsBefore operation-after operation latency time (s) at 7 weeks and 11 weeks.The results showed as n=6;**P<0.01,***P<0.001 vs LPS;###P<0.001 vs PBS.TEN:Tenuigenin;PD:Parkinson’s disease;PBS:phosphate-buffered saline;LPS:lipopolysaccharide;ASP:aspirin.

旷场实验中，图4可见，TEN及ASP均可改善PD模型大鼠的自主活动行为。模型组较其他组别，在运动的总距离、水平活动次数、运动时间及刻板计数方面都明显缩短和减少，TEN低剂量组、高剂量组及ASP药物组可以延长或增强PD模型大鼠的活动总距离、水平活动次数、活动时间及刻板计数情况，分别达模型组的321%、253%和279%，204%、165%和185%，243%、205%和205%，210%、167%和204%，同时休息时间较模型组缩短，下降至模型组的87%、90%和91%，差异有统计学意义。其他各组间差异无统计学意义。

图4 TEN对PD模型大鼠旷场实验的影响Fig.4 Effects of TEN on the locomotor activity of PD ratsA:total movement distance;B:horizontal activity;C:movement time;D:stereotypy counts;E:rest time;F:the track-plot pictures of rats in half-hour.The results showed as n=6；*P<0.05,**P<0.01 vs LPS;#P<0.05,##P<0.01 vs PBS;TEN:Tenuigenin;PD:Parkinson’s disease;PBS:phosphate-buffered saline;LPS:lipopolysaccharide;ASP:aspirin.

2.2 TEN降低PD模型大鼠黑质及血浆中TNF-α和IL-1β浓度

本实验采用ELISA方法，检测了黑质及血液中细胞因子TNF-α和IL-1β的浓度。结果显示，经过黑质内注射10 μg LPS诱导后，模型组损伤侧黑质内TNF-α的蛋白含量达3.904 pg/mg，IL-1β的蛋白含量达6.92 pg/mg(图5)，分别比对照组增加了86%及458%。TEN低剂量组、高剂量组及ASP药物组损伤侧两种细胞因子的浓度均低于模型组，其中TNF-α的浓度分别降低47%、38.3%和19.7%(图5A)，同时IL-1β的生成也受到TEN的明显抑制，浓度分别降低45.1%和82.1%，ASP组也有一定抑制作用，但与模型组比较，差异无统计学意义(图5B)。各实验组血液中两种炎性反应因子也有差别，模型组血液中TNF-α的浓度为279.8 pg/mg，IL-1β的浓度为347.8 pg/mg(图5C，D)，分别比对照组增加了41.5%和3.9%。TEN低剂量组、高剂量组及ASP药物组TNF-α的浓度低于模型组，分别为模型组的39%、29.1%和42.7%，其中TEN低剂量组及ASP药物组的差别有统计学意义(图5C)，3个药物组IL-1β的浓度略低于模型组，差异无统计学意义(图5D)。以上结果显示TEN有效地抑制了LPS诱导的小胶质细胞合成和释放细胞因子，ASP也具有一定的抑制作用，但从实验结果分析，效果较TEN差。

图5 TEN对PD模型大鼠黒质及血浆中炎性反应因子含量的影响Fig.5 Effects of TEN treated on the concentrations of proinflammatory cytokines in the SNpc and plasma of PD ratsThe concentration of TNF-α and IL-1β LPS were detected using commercial ELISA kits.The results showed as n=4-6(A，B)，n=5(C,D);*P<0.05 vs LPS;#P<0.05,##P<0.01 vs PBS;TEN:Tenuigenin;PD:Parkinson’s disease;PBS:phosphate-buffered saline;LPS:lipopolysaccharide;ASP:aspirin;TNF-α:tumor necrosis factor-α;IL-1β:interleukin-1β;SNpc:substantia nigra pars compacta.

2.3 TEN增加PD模型大鼠黑质致密部DA能神经元的数目

TH是DA合成的限速酶，存在于DA能神经元的胞质内，通过TH免疫组织化学染色法，可以鉴定DA能神经元，并观察DA能神经元形态和数量的改变。TH免疫组织化学染色的结果显示，模型组黑质内注射LPS后，注射侧(右侧)黑质致密部的DA能神经元大量死亡(图6A)，与非注射侧(左侧)相比残存的神经元只有62%；TEN 300 mg/kg组黑质致密部的TH阳性细胞形态正常，结构完整，数目明显多于模型组，存活率可达85%；TEN 200 mg/kg组及ASP 32mg/kg组黑质致密部的TH阳性细胞数目有上升趋势，但和模型组相比差异无统计学意义(图6B)。

图6 TEN对PD模型大鼠黑质TH阳性神经元存活率的影响Fig.6 Effect of TEN of the survival faction of TH-positive neurons in substantia nigra pars compacta of PD rastsA:HE staining;B:statistic data.Photomicrographs were captured using a SPOT-2 imaging analysis system.The scale bar represents 500 μm.The results showed as n=4;*P<0.05 vs LPS;##P<0.01 vs PBS;TEN:Tenuigenin;PD:Parkinson’s disease;TH：tyrosine hydroxylase;PBS:phosphate-buffered saline;LPS:lipopolysaccharide;ASP:aspirin.

2.4 TEN对PD模型大鼠主要脏器组织形态学无可见改变

以TEN灌胃方式治疗PD模型大鼠，对其心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺脏器官的组织形态学无明显影响(图7)。

图7 TEN对主要代谢器官的组织形态学无明显影响Fig.7 TEN has no visible morphology changes in the main organs of ratsAt 12 weeks,rats were decapitated,and the main organs were quickly separated,fixed with formaldehyde,embedded in paraffin,HE stained after sectioning,and no obvious morphological changes were observed under light microscope.The scale bar represents 200 μm.n=5;TEN:Tenuigenin;PBS:phosphate-buffered saline;LPS:lipopolysaccharide.

3 讨论

由于PD的病因和发病机制至今不明，因此临床尚无有效的治疗手段，目前以药物治疗为主，采用的是以DA前体物质——左旋多巴(levodopa,L-Dopa)为主的药物替代疗法，但该法只能改善症状，不能控制PD进程，长期应用会出现严重的不良反应——“开-关”现象。本实验室大量研究[13-18]表明，雷公藤内酯醇(T10)、海带褐藻多糖硫酸酯、远志皂苷等中药单体及有效成分均具有神经保护作用，对PD模型动物的DA能神经系统有较好的保护和治疗作用，具体作用途径与抗感染、抗氧化机制密切相关。中药治疗以其毒副作用小，协同作用强和整体调节的优势，为PD药物防治研究提供了良好前景。研究[19-21]表明，在PD疾病进程中DA能神经元的损伤与小胶质细胞炎性反应密切相关，因此本研究中选取常用于激活小胶质细胞的工具药物——LPS构建炎症性PD大鼠模型。大鼠脑黑质部位定点注射LPS可诱导小胶质细胞的激活，并伴有该部位神经元丢失，模拟了PD患者脑部病变特点。一定剂量的LPS注射可造成明显的动物旋转行为异常，引起CD11b阳性的小胶质细胞数量增多，呈明显激活状态，继而导致黑质致密部DA能神经元的退变、数量减少，纹状体DA及其代谢物含量降低，且该模型随时间延长对DA能神经元的损伤进行性加重，类似于人类PD患者病情缓慢进行性加重的特点。此模型用于研究炎性反应在PD发病过程中的作用，适用于通过干预炎性反应，发挥对DA能神经元的保护作用。同时，为模拟临床中药治疗方式，以灌胃的方式给药，给药周期达到一个药物疗程(约为3个月)，观察药物对多巴胺能神经元的保护作用。资料[10]表明，换算成大鼠灌胃剂量为150～300 mg/kg，结合资料及前期实验结果，TEN大鼠灌胃的有效剂量在200～300 mg/kg之间，为此，选取了200 mg/kg和300 mg/kg两个药物剂量组进行实验。此外，有文献[22]显示，TEN具有一定的溶血毒性，碱水解后毒性显著降低，但仍需进一步的药物安全性检测。实验中，两个TEN剂量组，长期以灌胃形式给药，未发现实验动物有不良反应，且通过脏器切面HE染色观察，对主要代谢器官心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的组织形态学没有明显影响，显示TEN适当剂量口服给药，具有较好的安全性。

无论是体内还是体外实验，TEN均显示出较强的抗感染活性。例如，TEN可以治疗LPS所致的小鼠急性肺损伤，可以抑制LPS所致的巨噬细胞RAW 264.7的激活，减轻LPS/GalN诱导的小鼠急性肝损伤[23]。TEN同时具有神经保护作用，不仅可以通过抑制超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶及减少tau蛋白的过度磷酸化，发挥对神经元的保护作用[24-25]，而且可以通过抗Aβ聚集、抗感染、抗氧化、抗神经元细胞凋亡，增强中枢胆碱能系统，促进神经元增生，发挥对AD相关的多重神经保护功能，改善AD模型鼠的认知行为[26-27]。本课题组既往的研究[11-12]显示，TEN不仅可以通过清除一氧化氮(nitric oxide,NO)自由基，抑制小胶质细胞活化释放基质金属蛋白酶-9、TNF-α和IL-1β，发挥对神经元的保护作用，还可以通过减少活性氧自由基产生，抑制小胶质细胞中核苷酸结合寡聚化结构域受体家族3炎症小体激活，减轻炎性反应对神经元的损伤。本研究显示，TEN能抑制LPS所致的炎症性PD模型大鼠的外周血浆和脑内黑质炎性反应因子的浓度，减少DA神经元的丢失，减轻PD模型大鼠的行为学损伤，证明这种神经保护作用与其抑制小胶质细胞炎性反应密切相关。

阿司匹林作为一种临床常用的非甾体类抗炎药，具有解热、镇痛、抗感染等功效，其抗感染机制与抑制前列腺素(prostaglandin,PG)合成酶，减少PG类致炎物质的合成有关，因此本研究选取ASP作为阳性对照药。TEN在细胞水平可以通过抑制PGE2及NO发挥抗感染作用[28-30]，本研究显示，高剂量TEN组抑制黑质炎性反应因子的效果明显优于ASP组，保护黑质DA神经元的作用也优于ASP处理组，说明TEN可以通过多种途径发挥抗感染作用，其神经保护作用优于ASP。研究同时显示，TEN对外周血浆中炎性反应因子的抑制效果不如对脑内黑质中炎性反应因子的抑制效果，推测可能与TEN水解成分药代动力学有关。文献显示[22,31]，远志皂苷水解产物多样，主要成分为3,4,5-三甲氧基肉桂酸(3,4,5-Trimethoxy-cinnamylic acid,TMCA)、对甲氧基肉桂酸(p-Hydroxy methyl cinnamate,PMCA)和细叶远志皂苷(Tenuifolin,TF)。动物实验经口服给药后，TMCA和PMCA能快速达到较高的血药浓度峰值(6.33 μg/mL和4.54 μg/mL)，发挥作用后被很快消除，体内滞留时间短，且不能通过血脑脊液屏障；而TF达到血药浓度的峰值时间长，虽然峰值低(0.37 μg/mL)，但可以通过大鼠血脑脊液屏障到达脑组织(药物峰值可达到0.25 μg/mL)，且滞留时间长，有利于其发挥生物学活性。因此，笔者推测TEN在脑内很可能是通过TF发挥抑炎作用。本研究证明了TEN可以通过抑制炎性反应因子TNF-α和IL-1β的释放，保护DA神经元，但其抗感染作用的分子机制尚未阐明，亟待进一步深入研究。

综上所述，本研究显示TEN能够改善炎症性PD模型大鼠的行为学损伤，减轻黑质DA能神经元的丢失，抑制LPS诱导的黑质小胶质细胞分泌促炎因子。TEN作为传统中药远志的提取物，具有较好的安全性，开发其作为PD防治药物有很好的临床应用前景。