高脂饮食通过抑制Wnt/β-catenin信号介导对骨质疏松大鼠骨密度和骨修复的负面影响

黄勤勤 季峰 钟佰强 施超枝

1. 浙江大学医学院附属第一医院消化科，浙江 杭州 310000 2. 金华市第五医院内科，浙江 金华 321000

尽管骨修复研究取得了重大的进步，但在大约10%的骨折中仍出现非正常愈合情况，正常的骨愈合仍然是一个挑战[1]。骨重塑的过程涉及局部和系统调节，并受到各种因素的影响，如年龄、既往疾病、吸烟、药物、糖尿病和饮食[2]。高脂肪饮食(HFD)导致体内脂肪积累，出现脂肪细胞的肥大[3]。富含脂肪的食物在亚洲国家越来越普遍，其对骨愈合的影响近年来也引发关注[4]。已有研究[5]报道HFD对骨量有负面影响，可以增加老年人的钙排泄、降低骨折的机械强度，导致矿物质含量降低和抑制成骨细胞形成。体脂和骨骼之间的关系是由脂肪因子介导的，脂肪因子调节骨骼重塑和脂肪生成[6]。此外，骨和脂肪之间的稳态反馈在这种关联中也起着重要的作用。身体脂肪的积累也增加了胰岛素抵抗的风险，导致2型糖尿病，这可能与骨愈合延迟有关[7]。然而，没有证据表明饮食脂肪水平与骨质疏松骨缺损愈合之间的关系。因此，本研究的目的是通过骨质疏松骨缺损模型来评估HFD对骨愈合的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

56只3月龄雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠纳入本研究，在受控的环境温度(22±1)℃和相对湿度45%～50%的条件下随意饲养，水和食物可以自由接触。自动控制明暗周期约12 h。所有程序均经医院动物伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1模型建立：通过腹膜内注射3%戊巴比妥(剂量为50 mg/kg)麻醉大鼠，并准备进行手术。OVX组大鼠接受卵巢切除术：双侧切口是通过腰部背外侧至腰椎腹侧。然后打开腹膜，牵拉出卵巢和包裹脂肪，结扎子宫角和卵巢血管，并去除卵巢，用可吸收的缝合线封闭切口；Sham组的大鼠接受假手术：卵巢周围的部分脂肪被去除，但卵巢保留在原处。手术后用安尔碘皮肤消毒剂对切口部位进行3 d的消毒。

1.2.2模型建立和HFD食物喂养：切除卵巢的两只大鼠在麻醉后死亡。其余大鼠随机分为以下组：假手术组(Sham，n=18)、卵巢切除模型组(OVX，n=18)、卵巢切除模型组+高脂肪饮食组(OVX+HFD，n=18)。12周后，在大鼠的股骨上进行钻孔。通过腹膜内注射40 mg/kg的3%戊巴比妥麻醉大鼠。在右股骨外侧进行皮肤切口，并进行股四头肌钝性解剖以暴露股骨干骺端。然后制作一个直径1.5 mm 圆形缺损，通过注入盐水冲洗孔，以从空腔中去除骨碎片，随后逐层缝合筋膜和皮肤。通过Micro-CT在体外以9 μm的分辨率对钻孔的局部位置进行了评估，以评估其愈合进度。Sham组和OVX组大鼠食用的食物是根据美国营养学会(AIN-93G)的建议[8]生产的，OVX+HFD组大鼠食用一种改良的AIN-93G饮食，其中饱和脂肪的热量含量为60%。每周测量大鼠的体重和每组的采食量。

1.2.3样本的收集：三组大鼠分别在缺损术后第2周(n=9)和4周(n=9)处死一部分标本。收集双侧股骨和血清标本。使用ELISA试剂盒(Cusabio，武汉)评估血清雌二醇(E2)水平。根据制造商提供的协议使用标准试剂盒(南京建城生物工程研究所)，通过标准比色法分析血清中碱性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的浓度。在680型酶标仪(Bio-rad Corp，费城，宾夕法尼亚州，美国)上测量吸光度。

1.2.4使用微计算机断层扫描(Micro-CT； YXLON International GmbH，德国)评估HFD对OVX大鼠骨缺损愈合的影响：使用VG Studio 2.1 V软件(版本2.6)对股骨进行扫描，并用X射线对18 μm(像素)处的管电压为80 kV且电流为60 μA的X射线进行成像。通过使用CT分析仪软件绘制定制轮廓来提取皮质骨。获得骨密度(bone mineral density, BMD)、小梁厚度(Tb.Th)、小梁骨体积分数(BV/TV)、小梁数(Tb.N)，小梁分离度(Tb.Sp)来自于Micro-CT的3D渲染图像。

1.2.5三点弯曲试验测量外在和内在生物力学材料特性：在材料测试系统(MTS-858，MTS system Inc.，Minneapolis，MN，USA)下对解冻后的右股骨进行机械测试。在中轴施加载荷，两个支撑件之间的中点相距10 mm。以2 mm/min的恒定速度记录载荷位移曲线和变化力，直到发生骨折。用游标卡尺测量骨折处股骨的内外宽和高度。最大载荷、线性斜率、弹性模量、能量吸收直接由载荷变形曲线确定。

1.2.6股骨缺损部位组织基因分析：使用EASYspin Plus骨组织RNA试剂盒(Aidlab；中国)从股骨中分离总RNA。使用CFX96实时PCR检测系统(BIO-RAD Laboratories，Hercules，CA，美国)分析基因的表达。使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Invitrogen；美国)进行逆转录。使用Light Cycler 480 SYBR Green I Master试剂盒(Bio-rad；美国)进行RT-qPCR以定量mRNA样品和重塑标记的表达。以45个循环进行扩增反应(95 ℃持续10 min；95 ℃持续15 s；60 ℃持续1 min；72 ℃持续30 s)。甘油-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)被用作管家基因进行标准化。基因表达的相对变化通过2 Ct法分析。所有实验至少重复三遍。指定使用的引物如下：Wnt1的GTT TAC GCC ATC TCC TCA GC(正向)和GGT ACC TTT GCT GTC CTT GC(反向)，TCT TTG GAG CCA CCG ATT A(正向)和TTT CCA CCA ACT GAT CCA GSK-3β的CA(反向)，Smad 3的GAG ACA TTC CAC GCT TCA CA(正向)和GCT GCA TTC CGG TTA ACA TT(反向)，CCA GGT CTC TTG ATG GTC GT(正向)和GCG TAT TCG CAG TTC Smad 2的TCG AT(反向)，CTT ACG GCA ATC AGG AAA GC(正向)的TCG AT(反向)和β-catenin的TCA GCA CTC TGC TTG TGG TC(反向)，CGA CTG TTA GAA CTC CCT CA(正向)和CAT TGG GGG TAG GAPDH的GAA CAC(反向)。

1.3 统计学分析

结果使用均数±标准差表示。使用SPSS 20.0进行统计分析。采用单因素方差分析评估三组之间是否存在差异，一旦检测到之间存在显著差异，则使用Tukey’s多重比较检验来确定每两组之间的显著性。P<0.05表示比较差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清E2、ALP和TRAP水平

血清E2的检测为了观察HFD是否影响大鼠血清激素表达(图1a)。与Sham组相比，OVX和OVX+HFD组的血清E2水平均显著降低(P<0.05)。血清ALP和TRAP的活性如图1b、图1c所示，OVX组的血清TRAP浓度显著高于Sham组(P<0.01)，但与OVX组相比，OVX+HFD组明显降低(P<0.01)。此外，与Sham组相比，OVX+HFD组的血清ALP浓度显著低于Sham和OVX组(P<0.05)。

图1 HFD对血清E2、ALP和TRAP水平的影响 a:E2；b:ALP;c:TRAP。注：与Sham组相比，**P<0.01；与Sham组相比，*P<0.05；与OVX组相比，##P<0.01。Fig.1 Effect of HFD on serum E2, ALP, and TRAP levels

2.2 Micro CT分析

进行Micro-CT分析以检测骨缺损部位的愈合。HFD治疗对大鼠股骨缺损部位修复影响的Micro-CT二维和三维图像如图2所示，对缺损后2周和4周的损伤皮层骨进行了定量分析。Micro-CT 3D图像显示，与Sham组大鼠相比，OVX组大鼠的小梁骨少、小梁结构紊乱、小梁骨间隙扩大和分离度增加。OVX组大鼠的BMD、Tb.N、Tb.Th和BV/TV明显低于Sham组大鼠，而OVX组Tb.Sp明显高于Sham组大鼠。OVX+HFD组的BMD、Tb.N和Tb.Th显著低于OVX组，而Tb.Sp则明显高于在OVX组。

图2 Micro-CT观察HFD对去卵巢大鼠股骨缺损愈合指标的影响注：与Sham组相比，**P<0.01；与Sham组相比，*P<0.05；与OVX组相比，##P<0.01。Fig.2 Micro-CT to observe the effect of HFD on the healing index of femoral defect in ovariectomized rats

2.3 生物力学检查

进行三点弯曲测试以测试大鼠股骨的生物力学性能改变。去卵巢大鼠的力学性能明显降低，表明为极限载荷、刚度、能量吸收和弹性模量均显著低于Sham组大鼠(P均<0.05)。然而，HFD干预后明显降低了去卵巢大鼠骨缺损部位的极限载荷、刚度、能量吸收和弹性模量(P均<0.05)。见表1。

表1 HFD对去卵巢大鼠股骨力学性能的影响(n=6，每组)

2.4 基因表达分析

进一步检测Smad2、Smad3、Wnt1、GSK-3β和β-catenin的mRNA表达。如图3所示，与Sham组相比，OVX组中Smad2、Smad3和GSK-3β的mRNA表达显着增加(P<0.01)；与OVX组相比，OVX + HFD组Smad2、Smad3和GSK-3βmRNA表达显著增加(P<0.01)，OVX组的Wnt1和β-catenin的mRNA表达低于Sham组(P<0.01)。然而，与OVX组相比，OVX+HFD组中的Wnt1和β-cateninmRNA表达均显著降低(P<0.01)。

3 讨论

本研究观察了HFD对去卵巢大鼠骨缺损愈合及BMD的影响。研究发现，HFD可以显著降低去卵巢大鼠股骨骨缺损愈合速度而且影响缺损部位骨强度；同时影响骨重建过程中反映成骨、破骨活性的ALP和TRAP水平。

HFD与肥胖发展相关[4]。此前，人们认为肥胖对骨骼是有有益的，因为机械负荷的增加刺激了骨的形成[9]。这一假设得到了骨适应以保持最佳大小和特性以支持特定载荷论点的支持[9]。然而，最近的报道[10]表明，体重增加可能与骨量呈负相关，脂肪细胞分化和成骨细胞分化之间可能存在竞争效应，因为它们具有共同的祖细胞。有学者[11]研究观察到HFD引起体重增加并不能减轻骨丢失。虽然外部负荷被认为是骨形成的积极刺激[11]，但脂肪积累并不能防止骨丢失。脂肪组织不是具有储存能量的唯一功能的惰性器官；它具有代谢功能，分泌与骨代谢有关的蛋白质。

图3 HFD对大鼠股骨Wnt信号通路相关基因表达的影响注：与Sham组相比，**P<0.01；与Sham组相比，*P<0.05；与OVX组相比，##P<0.01。Fig.3 Effect of HFD on the expression of Wnt signaling pathway-related genes in rat femurs A：Smad3；B：Wnt1；C：GSK-3β；D：β-catenin。

事实上，HFD对内分泌刺激比机械刺激对骨代谢的影响更大。有证据[12]表明HFD可以引起生长小鼠骨结构的负改变。此外，由于接受HFD的大鼠可能具有骨脆性，创伤性骨折可产生不同组间的骨碎裂。在本次研究中，与OVX组和Sham组大鼠相比，HFD大鼠股骨缺损部位的最大载荷较低，说明其生物力学性能受到损害。不平衡的重塑可以影响骨结构、质量和强度[13]，因此，形态学研究与力学试验相补充，可以更广泛地了解骨质量方面及其抵抗骨折的能力[14]。HFD降低了缺损部位修复进程，也降低了与生物力学特性相关的骨骼强度。HFD喂养的去卵巢大鼠的骨骼中极限负荷较低，而BMD也在降低。在HFD喂养的大鼠的骨缺损部位观察到骨形成降低的趋势。

Wnt/β-catenin信号通路与成骨分化的刺激、骨形成和骨质疏松的预防密切相关[15]。Wnt信号转导的关键步骤是通过诱导GSK-3β磷酸化来破坏细胞质GSK-3β复合物，随后抑制β-catenin磷酸化，从而稳定β-catenin[16]。同时，累积的β-catenin进入细胞核并激活Wnt靶基因的表达[17]。在本研究中，HFD促进了GSK-3β的表达，HFD的存在抑制了β-catenin的表达。GSK-3β的表达明显被HFD上调，表明Wnt /β-catenin信号被HFD灭活。去卵巢手术后Wnt/β-catenin信号被显著抑制，其中的β-catenin和Wnt1表达较Sham组明显降低；而HFD干预后发现β-catenin和Wnt1表达进一步降低且修复效果进一步降低；这些结果表明HFD可以通过抑制Wnt /β-catenin信号传导来抑制骨缺损愈合。

当然本研究也存在不足之处。首先，研究时间较短，样本数量较少；其次，使用高脂肪饮食的方案系参考先前的研究，因此对研究结果可能有影响；最后，仅初步探讨了HFD对骨质疏松骨缺损愈合及对Wnt/β-catenin信号的影响，但具体机制及HFD和骨愈合之间的关系还有待进一步探索。

总的来说，本研究表明了HFD对骨质疏松状态下骨缺损愈合有负面影响，而这种影响可能是通过对Wnt/β-catenin信号传导抑制来实现的。