TCF7L2 rs290481基因多态性与2型糖尿病合并冠心病相关

骆时木， 欧阳航， 蒋燕成， 张志珊

(福建医科大学附属泉州第一医院 检验科， 福建 泉州 362000)

心血管疾病尤其是冠心病(coronary heart disease, CHD)的发病率在糖尿病(diabetes mellitus, DM)人群中明显增高，它是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)最为常见的并发症，同时也是糖尿病患者的常见死亡原因。据相关研究报道，糖尿病患者由于冠心病所引发的病死率比非糖尿病患者高2～4倍[1]。但目前有关2型糖尿病增加冠心病患病风险的机制尚未完全阐明。研究表明，T2DM合并CHD有明显家族及种族会集性，其发病风险中遗传因素起着重要的作用，许多与T2DM患病风险相关的基因位点同时与冠心病的高风险相关[2]。

在众多易感基因中，TCF7L2是目前发现的与2型糖尿病相关性最强的基因[3-7]，但其与T2DM合并CHD发病风险的相关性国内研究较少。在TCF7L2基因众多SNP位点中，rs7903146、rs12255372、rs290487、rs11196205、rs290481被认为与T2DM易感性有关。TCF7L2 rs290481基因多态性可能影响胰岛β细胞胰岛素分泌功能，从而引起血糖升高[4]，被认为与T2DM发生相关，但目前尚无rs290481多态性与T2DM合并CHD发病风险的相关性报道。本文探讨TCF7L2基因rs290481位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNPs)与2型糖尿病合并冠心病发病风险的相关性，以期为2型糖尿病易患冠心病的高危人群提供预警，为临床动脉粥样硬化性心血管病的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象：选取2017年12月到2018年6月福建医科大学附属泉州第一医院临床患者和健康体检人群作为研究对象，共480例，且已排除家系(血缘)关系。对照组120例均经有关检查排除冠心病，同时无高血压、糖尿病等病史。T2DM组120例为内分泌科就诊并诊断为2型糖尿病的患者，其诊断初期口服降糖药物治疗有效，全部患者采用饮食或药物控制血糖，未使用胰岛素治疗，无CHD病史及其他并发症。CHD组为选择同期在心内科因CHD住院的患者120例，具有符合冠脉造影检查证实冠脉狭窄≥50%者，或者既往有明确心肌梗死病史者，无DM病史及其他并发症。T2DM+CHD组120例为同期心内科因冠心病住院的2型糖尿病患者，冠心病和2型糖尿病诊断标准同上。

本研究得到了医院伦理委员会的批准(泉-伦[2017]147号)，所有受试者均在实验前了解本实验的目的并签署知情同意书。

1.1.2 试剂：生化测定试剂盒(贝克曼公司)；HbAlc检测试剂盒(日本爱科来公司)；全血DNA提取试剂盒 (Qiagen公司)；引物合成和Taq聚合酶[TaKaRa宝生物工程(北京)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 标本的收集和保存：禁食12～14 h后，于次日清晨采静脉血2管。其中1管不抗凝血3 mL，分离血清后用于生化指标检测；而另1管EDTA-K3抗凝血3 mL，其中1 mL用于糖化血红蛋白测定(HbAlc)，剩余标本用于提取基因组DNA。

1.2.2 生化指标检测：高效液相色谱法检测HbAlc。全自动生化分析仪测定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、ApoA和ApoB。葡萄糖氧化酶法测定血糖，酶法测定TC、TG、HDL-C和LDL-C，免疫法测定ApoA和ApoB。实验均严格按照标准操作规程进行操作检验，用高低两个水平配套质控品进行质量控制。

1.2.3 基因多态性的检测：QIAGEN试剂提取外周血DNA，超微量紫外可见分光光度计检测其DNA浓度及纯度。在NCBI数据库上下载目标SNP位点上下500 bp的基因序列，用引物设计软件primer premier5.0设计下列引物：TCF7L2-rs290481(409 bp)：上游引物:5′-CAGTGACATTGTCTGACAGTGG-3′(22 bp)，下游引物:5′-ACTAATTTTGCCCTGCACCAA-3′(21 bp)。引物由TaKaRa合成。PCR反应总体积30 μL，包括10×缓冲液3 μL，dNTP 2.4 μL，正向引物和反向引物各0.6 μL，模板DNA 1.5 μL，Taq酶0.15 μL及ddH2O 21.75 μL。PCR循环条件：95 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，57.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共进行35次循环；最后延伸72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物用3%的琼脂糖凝胶电泳，EB(溴化乙锭)染色，凝胶成像仪观察结果，以DL500 DNA marker作为参照。扩增产物由北京六合华大基因科技有限公司进行测序，Chromas软件分析测序结果。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般临床资料

4组研究对象的一般临床资料比较(表1)。与正常对照组相比较，T2DM组、CHD组、T2DM+CHD组BMI、收缩压、舒张压和HbAlc水平均高于对照组，而 HDL-C、ApoA和ApoB水平低于对照组(P<0.05)， T2DM组GLU、TC、TG和LDL-C高于对照组(P<0.05)，T2DM+CHD组GLU、TG高于对照组(P<0.05)。

与T2DM组比较，CHD组、T2DM+CHD组收缩压、HbAlc低于T2DM组，T2DM+CHD组BMI、TC、HDL-C、LDL-C和ApoA低于T2DM组(P<0.05)。

与CHD组比较，T2DM+CHD组的收缩压、HbAlc、GLU和TG大于CHD组，HDL-C、ApoA水平低于CHD组(P<0.05)。

2.2 4组研究对象TCF7L2 rs290481基因多态性基因型频率的分布

TCF7L2 rs290481基因多态位点在对照组(χ2=0.700)、T2DM组(χ2=4.247)、CHD组(χ2=3.333)及T2DM+CHD组(χ2=1.864)基因型频数分布均符合 Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，所研究的基因型频数和预期的基因型频数相符合，具有群体代表性。

对照组与T2DM组、对照组与CHD组、T2DM组与CHD组、T2DM组与T2DM+CHD组、CHD组与T2DM+CHD组的基因型分布频率均存在显著性差异(P<0.05)(表2)。

2.3 TCF7L2 rs290481各基因型之间生化水平比较

TCF7L2 rs290481基因位点AA基因型HbAlc、GLU水平高于AG+GG基因型(P<0.05)。各组内TCF7L2 rs290481 基因型与各生化指标没有相关性(表3)。

2.4 T2DM合并CHD危险因素的二分类Logistic回归分析

将全部研究对象作为整体进行二分类Logistic回归分析。二分类划分标准如下：性别(女性为0，男性为1)；年龄(<60岁为0，≥60岁为1)； 高血压病史(无为0，有为1)；BMI(<24 kg/m2为0，≥24 kg/m2为1)；rs290481基因型(AA为0，AG+GG为1)等作为自变量(X)；血脂按照《中国成人血脂异常防治指南》，将血脂分层切点分为不同的等级：TC(<5.18 mmol/L为0，≥5.18 mmol/L为1)；TG(<1.70 mmol/L为0，≥1.70 mmol/L为1)；HDL-C(≥1.04 mmol/L为0，<1.04 mmol/L为1)；LDL-C(<3.37 mmol/L为0，≥3.37 mmol/L为1)；GLU(<6.11 mmol/L为0，≥6.11 mmol/L为1)；HbAlc(<6.0%/L为0，≥6.0%为1)分别将是否有2型糖尿病(否为0，有为1),是否有冠心病(否为0，有为1)和是否有T2MD合并CHD(否为0，有为1)作为因变量(Y)，其他指标作为自变量(X)。分别校正年龄、性别等相关因素后，分析结果显示：高血压病史(OR=4.136)、HbAlc(OR=697.561)、Glu(OR=85.555)是本研究对象中发生2型糖尿病的独立危险因素；BMI(OR=1.929)、高血压病史(OR=3.537)是发生冠心病的独立危险因素；高血压病史(OR=2.121)、HbAlc(OR=22.606)、GlU(OR=9.023)是发生T2DM合并CHD的独立危险因素，HDL-C是预防冠心病(OR=4.049)和T2DM合并CHD(OR=2.764)的保护因素；rs290481基因型是发生冠心病的独立危险因素(OR=3.303)，同时也是发生T2DM合并CHD的独立危险因素(OR=4.291)。

表1 4组研究对象一般临床资料比较Table 1 Comparison of general clinical data in four

表2 4组研究对象组TCF7L2 rs290481基因型及等位基因频率分布的比较Table 2 Comparison of genotype and allele frequency distribution of TCF7L2 rs290481 in four groups

表3 所有研究对象TCF7L2 rs290481各基因型间生化项目比较Table 3 Comparison of biochemical items between genotype AA and AG/GG of rs290481 in all research objects

3 讨论

TCF7L2编码产物是Wnt信号通路的关键蛋白，Wnt信号通路通过促进肠道内分泌L细胞分泌胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，在调节血糖稳态中起关键作用[8]。TCF7L2多态性可能通过间接减少肠内分泌细胞GLP-1的分泌，增加2型糖尿病患病风险[9]。

TCF7L2 rs290481基因多态性与T2DM的相关性国内报道并不一致。本研究rs290481位点共检测到177个AG杂合型突变、106个GG纯合型突变，突变率为58.9%，与福州地区结果相近[10]。T2DM组rs290481 AA、AG、GG基因型分布频率与正常组、CHD组和T2DM+CHD组比较均有显著性差异，但不是T2DM的独立危险因素，与国内的报道并不完全一致[11-13]。这可能与地域差异有关。另一方面，本研究结果显示rs290481位点与CHD、T2DM合并CHD有明显关联，rs290481位点AG/GG基因型携带者患T2DM合并CHD的风险是AA基因型携带者的4.291倍，是T2DM合并CHD的独立危险因素(OR=4.291)。

目前认为rs290481多态性可能影响胰岛β细胞功能，从而引起血糖升高[4]。有研究表明健康对照组rs290481位点GG基因型携带者空腹血糖水平显著高于AA基因型携带者[11]。为了进一步了解rs290481多态性是否通过影响血糖水平进而增加T2DM合并CHD的易感性，本研究进一步分析各组内rs290481基因型与血糖的相关性，结果发现在4个研究组内rs290481 基因型与血糖、血脂等各项生化指标均不存在相关性。但将所有研究组作为观察对象后，发现AA基因型GLU和HbAlc水平均高于AG+GG基因型，原因可能是由于纳入糖尿病患者导致的差异，rs290481基因型是否与糖类代谢有关有待于进一步扩大样本进行分析。

T2DM合并CHD是糖尿病全身大血管病变的一种表现，为了解T2DM合并CHD的危险因素，本研究Logistic回归分析显示,高血压病史、HbAlc和GlU是T2DM合并CHD的独立危险因素，HDL-C是预防T2DM合并CHD的保护因素。TCF7L2基因rs290481位点AG/GG基因型增加冠心病、T2DM合并CHD患病的风险。

综上所述，本研究提示TCF7L2 rs290481基因位点AG/GG基因型是T2DM合并CHD发生的独立危险因素，可为2型糖尿病合并冠心病的高危人群提供预警，为疾病的诊疗提供实验室依据。但由于本研究纳入的标本量较少，结果存在一定的局限性，有待于进一步扩大样本量进行更全面的分析。