HCN4表达变化对兔窦房结缺血再灌注时电生理功能的影响

滕 林 曹春雨 周 飞 杨 伟 李 松 丁家望

(1.三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 心血管内科 & 三峡大学 心血管病研究所， 湖北 宜昌 443003； 2. 三峡大学 医学院， 湖北 宜昌 443002)

临床上右冠状动脉闭塞时，往往导致窦房结动脉灌注不足，影响窦房结功能，进而导致严重心动过缓、窦性停搏及高度房室传导阻滞等缓慢型心律失常的发生。右冠状动脉闭塞所致心律失常是急性缺血性心肌病最常见的并发症，也是导致心脏骤停甚至死亡的主要原因之一[1，2]。右冠状动脉闭塞所致窦房结灌注不足可引起一系列窦房结细胞形态结构与电生理功能改变，且其确切的分子机制尚未阐明[3-5]。

近年来的研究发现，超极化激活环核苷酸门控非选择性阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel，HCN channel) 在调控细胞的起搏电流及维持其电生理功能方面有着极其重要的作用，窦房结组织中的HCN异常表达可导致窦房结功能失调和心律失常等一系列心脏功能状态改变，而且这种异常表达可能是窦房结动脉灌注不足诱发心律失常发生的重要分子生物学基础[6，7]。前期在离体窦房结细胞缺血再灌注模型中，我们研究发现，HCN通道家族中HCN4 高表达于心脏窦房结细胞，并参与窦房结细胞起搏功能的调控过程。急性心肌缺血时窦房结细胞凋亡增多，HCN4表达下调，窦房结功能被抑制。而早期再灌注治疗可明显增加HCN4的表达，使得If通道电流密度增多而促进窦房结功能恢复[8，9]。由于HCN4高表达于窦房结组织，同时其具有作为起搏基因的相关电生理特性，又因窦房结动脉主要起源于右冠状动脉的解剖特点[10，11]，我们推断HCN4表达异常可能是临床上急性右冠缺血/再灌注事件后缓慢型心律失常发生的主要原因。因此，本研究在细胞研究基础上，以右冠状动脉结扎、再灌的新西兰大耳白兔为窦房结缺血再灌注模型，通过同步记录体表心电图及心腔内电图试图阐明HCN4在窦房结组织中的表达水平与缺血及缺血再灌注时窦房结电生理功能损伤及修复之间的关系，从整体水平探索窦房结急性缺血后缓慢型心律失常发生的分子机制，为心肌缺血后恶性心律失常的临床防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及设备

HCN4抗体(Santa Cruz公司)、羊抗兔β-actin抗体(美国Santa Cruz公司)；HRP标记二抗IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；Total DNA/RNA Protein Kit(OMEGA公司)；ECL发光液(武汉博士德生物工程有限公司)；反转录第一链cDNA合成试剂盒(上海天根生物有限公司)；PCR试剂盒及DNA分子量标准(Takara公司)；四道生理记录仪(RM-6200，成都仪器厂)、心电图机(ECG-6511 型，日本)、示波器(LMS-2A，日本) 、小动物呼吸机(HD-40，浙江医科大学仪器实验厂)。

1.2 实验动物

健康成年新西兰大白兔70只，雌雄不拘，体重2.5～3.5 kg，由三峡大学实验动物中心提供，符合国家医用动物使用标准，动物予以标准饲料喂养，自由摄食饮水，20℃～25℃条件下饲养2周后实验，实验前禁食12 h，禁饮4 h, 所有实验动物使用方案经过三峡大学动物伦理委员会审批通过。

1.3 兔缺血再灌注模型的建立与分组

按随机数字表法将新西兰兔随机分为对照组、缺血30 min、60 min、120 min 组及缺血120 min再灌注60 min、120 min、240 min组，每组10 只。对照组仅开胸不结扎右冠状动脉。手术组用3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)静脉麻醉后，切开颈部，分离出气管，倒“T”形切口插入气管插管行人工正压通气；然后分离、结扎及切断双侧迷走神经、双侧星状神经节及结扎所有的分支，以消除自主神经系统对窦房结电生理功能的影响；而后沿胸正中线稍偏右切开皮肤、皮下组织及肌肉，切断 2～5 肋暴露心脏，从主动脉根部分离出右冠状动脉，在右冠状动脉分出第一分支前的起始部下方套带一细橡胶管的结扎线，通过橡胶管钳夹或放松两端结扎线以造成窦房结动脉急性闭塞或再灌注。

由颈动脉插入自制的希氏束电极至主动脉根部记录希氏束电图(滤波：1 kHz；灵敏度：1 mv/cm)，同时用针形电极刺入兔四肢皮下记录体表心电图，将以上信号输入四导电生理记录仪并显示于示波器的荧光屏上，于各观察时相点同步记录希氏束电图及体表Ⅱ导联心电图(走纸速度25 mm/s)。数据记录完毕后，剪开上腔静脉和下腔静脉，于上腔静脉入口以下至腔耳角向外下沿界嵴到下腔静脉口这一区域切取窦房结组织，预冷的生理盐水冲洗窦房结组织，于液氮冻存并用于后续试验。

1.4 RT-PCR检测

提取窦房结组织RNA，逆转录成cDNA，与根据基因序列设计的引物、探针等混合后在PCR仪上反应并检测，引物系列如下：HCN4-F1：5′-GTACTC CTACGCGCTCTTCA-3′，R1：5′-GCTCTCCTCGTC GAACATCT-3′，313 bp；β-actin-F1：5′-CGGGAAA TCGTGCGTGAC-3′，R1：5′-TGGAAGGTGGACA GCGAGG-3′，266 bp。

1.5 Western blot检测

提取窦房结组织蛋白，定量后以SDS-PAGE凝胶分离，转印至杂交膜上。5%脱脂牛奶或3%BSA封闭非特异抗原后，一抗孵育过夜，TBST洗去非特异性结合一抗，HRP标记二抗室温孵育1 h，然后以TBST洗去非特异性结合二抗，加入ECL显影液室温孵育2 min，分析目标蛋白条带。

1.6 心电图及心内电生理检测

实验组分别于结扎右冠状动脉前、结扎右冠状动脉后30 min、60 min、120 min，缺血120 min再灌注后60 min、120 min、240 min同步记录体表心电图、心腔内电图。测量各组不同时相点AA 间期( p-p 间期)、AH 间期及HV 间期，记录心律失常的发生情况。若AA 间期较结扎右冠状动脉前延长>40 ms, 被视为AA 间期延长。以AH 间期延长≥20 ms 作为房室传导阻滞诊断标准，Ⅱ、Ⅲ度房室传导阻滞及其它心律失常以人类心律失常诊断标准判定[12]。对照组观察指标同上。

1.7 统计学分析

以SPSS 10.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，组间数据差异采用单因素方差分析，计数资料采用百分比表示，组间比较采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺血及缺血再灌注兔体表心电图变化及心律失常的评估

对照组10 只兔子均存活，无心律失常发生；缺血组不同时间点60只兔子(含缺血120 min再灌注组后30只)在缺血期共有49只发生窦性停搏、房室传导阻滞、窦性心动过缓伴不齐的缓慢型心律失常(81.67%)。其中缺血30 min组无死亡，心电图提示心率减慢，Ⅱ导联ST段较对照组明显抬高，P-R间期明显延长，发生不同程度房室传导阻滞；随着缺血时间延长，Ⅱ导联逐渐形成病理性Q波，T波逐渐倒置。缺血组不同时间点共有11只因发生心室颤动、室性心动过速及心房颤动等其他心律失常而死亡；其中缺血60 min后死亡2只，缺血120 min后(含缺血120 min再灌注后30只)共死亡9只，余存活大鼠均发生不同程度的心动过缓、窦性停搏及高度房室传导阻滞等缓慢型心律失常。缺血120 min后存活兔经再灌注后均无死亡；再灌注早期(1～5 min)出现不同类型的再灌注心律失常，以交界区缓慢型心律失常为主；随着再灌注时间的延长，心率逐渐恢复正常，ST段回落，病理性Q波明显加深，P-R间期恢复正常，逐渐恢复窦性心律。

2.2 缺血及缺血再灌注对兔窦房结组织HCN4表达的影响

PCR及Western blot结果显示，与正常对照组相比，急性缺血可诱导窦房结组织中HCN4 mRNA及蛋白水明显下降，随着缺血时间的延长，HCN4进一步下降(均P<0.05)；再灌注60 min后，HCN4 mRNA及蛋白水平较缺血组升高，随着再灌注时间的延长，HCN4 mRNA及蛋白水平明显上升(均P<0.05)，见图1。

2.3 对照组AA、AH、HV 间期的变化

对照组均未发生心律失常，心内电图未记录到窦性心动过缓、窦性停搏、窦房阻滞、房室传导阻滞等缓慢型心律失常的发生；AA 间期与开胸前相比，变化未超过40 ms。表明开胸后不结扎右冠状动脉，AA 间期、AH间期及HV间期与开胸前比较均无显著差异(均P>0. 05) ，见表1。

表1 对照组开胸前后AA、AH及AV间期的变化

2.4 缺血组AA、AH、HV间期的变化

心内电生理检查结果显示，与结扎右冠状动脉前比，结扎后30 min、60 min、120 min的AA、AH间期均有不同程度的延长，随着缺血时间的延长AA、AH也逐渐延长(均P<0.05)，HV间期与结扎前未见明显变化(P>0.05)，见表2。

表2 缺血前、后AA、AH及AV间期的变化

2.5 缺血再灌注组AA、AH、HV间期的变化

右冠状动脉再灌注后，均出现一过性的再灌注心律失常，以交界区缓慢型心律失常为主，于再灌注后5 min 内逐渐恢复正常。心内电生理检查结果显示，与再灌注前比，再灌注后60 min、120 min、240 min的 AA 、AH间期均有不同程度的缩短(均P<0.05)，而再灌注后各组HV间期未见明显变化(P>0.05)，见表3。

表3 缺血再灌注前、后AA、AH及HV间期的变化

3 讨论

心脏起搏冲动起源于上腔静脉与右心耳心内膜下的窦房结组织，这些冲动由特殊分化的心肌细胞形成，这些细胞能够产生维持窦性心律的动作电位[13]。窦房结血供主要由窦房结动脉支配，多数起源于右冠状动脉。因此，右冠状动脉急性闭塞将导致窦房结血流灌注不足，影响窦房结细胞状态，进而导致窦房结电生理功能的异常。正常的起搏电流参与窦房结自主节律的产生和控制，与心脏节律的维持密切相关，而窦房结电生理功能的异常又与其编码起搏电流离子通道家族的基因有明显关系[14]。

在心血管系统中， HCN通道高表达于心脏起搏细胞中，在参与心脏自主搏动和对节律的调节过程中发挥着重要的作用[15]。HCN通道是四聚体，类似于电压门控钾通道和环核苷酸调控的钾通道。已知有4种不同的亚型(HCN 1～4)，它们在心脏中都有不同程度的表达。尤其是HCN4亚型在窦房结表达最多，其次是HCN1和HCN2[16]。在人心脏中，HCN4是迄今为止发现在心脏窦房结、房室结、普肯耶纤维传导系统中表达量最高的HCN通道亚型，而周围心房组织中却无表达[17]。HCN4在窦房结细胞舒张期去极化过程中起到重要作用，由于其形成的离子通道具有生理性起搏电流(If)的特征，与心脏起搏的产生和调节关系密切，因此HCN4又被称为起搏基因[18]。HCN4的表达改变与多种心脏疾病、心律失常的发生密切相关。Stieber等[19]研究发现，窦房结急性缺血再灌注损伤后产生某些心律失常的原因可能是窦房结组织HCN4表达降低，使得其主导的起搏电流异常所致。Zicha等[20]研究表明，窦房结组织HCN4的表达下调参与了充血性心衰所诱导的窦房结电生理功能障碍。

急性冠脉综合征时窦房结电生理功能的异常与心肌缺血及缺血再灌注损伤的轻重、缺血时间长短密切相关。窦房结细胞作为一种特殊分化的心肌细胞，而HCN4作为起搏基因，极可能与心肌缺血时窦房结电生理功能的异常密切相关。在前期的研究中，我们通过建立窦房结细胞缺血再灌注模型发现，HCN4可能参与调控急性缺血缺氧时窦房结细胞的起搏功能，HCN4表达下降抑制窦房结细胞的电生理功能，而早期再灌注治疗可明显增加HCN4的表达，使得通道If电流密度增多而使窦房结功能恢复[8，9]。由于细胞离体模型的影响因素颇多，因此本研究在前期研究的基础上，体内实验进一步探讨HCN4介导急性右冠状动脉闭塞时窦房结电生理功能障碍的机制。

本研究在兔右冠状动脉急性闭塞与再灌注模型的基础上，观察了缺血及再灌注不同时间点窦房结组织HCN4 mRNA及蛋白表达水平，并探讨了其表达量变化与窦房结细胞电生理功能障碍的内在联系。研究发现，急性缺血时HCN4在窦房结组织中表达水平明显下降，随着缺血时间的延长进一步降低；而早期再灌注后可明显增强HCN4在窦房结组织中的表达。研究结果提示，起搏基因HCN4可能参与了急性心肌缺血时窦房结电生理功能障碍，导致心律失常的发生。

我们进一步观察缺血及缺血再灌注兔体表心电图、心内电图的变化，对缺血、缺血再灌注时心律失常进行评估，进一步明确HCN4与窦房结功能障碍的关系。研究结果表明，急性右冠状动脉闭塞诱导窦房结缺血时发生窦性停搏、房室传导阻滞、严重窦性心动过缓等缓慢型心律失常发生率较高，只有少数发生严重的心室颤动、室性心动过速及心房颤动等其他心律失常，而这些心律失常的发生可能与窦房结细胞急性缺血后自律性降低及邻近区域心房肌细胞缺血后心电不稳定性增加有关[21]。及时再灌注可明显减少缓慢型心律失常的发生，促进窦性心律的恢复。通过心内电生理进一步明确记录了缺血及缺血再灌注时AA、AH、HV 间期的变化。我们发现，急性窦房结缺血时AA、AH间期均有不同程度的延长，与缺血时间的长短有关，而HV间期未见明显变化。再灌注后均出现一过性的再灌注心律失常，表明窦房结组织存在再灌注损伤。随着再灌注冠脉血流恢复，AA、AH间期均有不同程度的缩短，而HV间期仍未见明显变化。这提示缺血时窦房结的电生理功能障碍与起搏基因HCN4密切相关，HCN4介导了缓慢性心律失常的发生。以上实验结果与既往研究相一致，窦房结组织的HCN4异常表达可能导致窦房结功能障碍，导致心律失常的发生[22]。窦房结组织HCN4表达降低可出现不同程度的窦性心动过缓；在窦房结内上调HCN4，可减少缓慢性心律失常的发生[23，24]。

窦房结缺血损伤导致HCN4的减少是窦房结功能障碍的主要原因，而及时开通闭塞的血管进行再灌注有利上调HCN4，促进窦房结功能的恢复，减少急性缺血所致缓慢性心律失常的发生。