富含花色苷的发酵型果酒色泽衰减原因及机制分析

梁舒妍，白卫滨，刘嘉惠，孙建霞*

（1.广东工业大学轻工化工学院，广东省植物资源生物炼制重点实验室，广州 510006；2.暨南大学理工学院，食品安全与营养研究院，广州 510632）

根据国家统计局（http://www.stats.gov.cn/）数据，2020年我国水果产量已达28 692.40万t，水果行业已成为继粮食、蔬菜之后的第三大农业种植产业。采摘后的水果容易腐败变质，失去食用价值，造成极大的浪费。为了综合开发水果资源，减少水果腐烂和粮食酿酒造成的浪费，我国发展了“以果代粮”酿酒[1]。酿造果酒对提高易腐水果产品附加值、促进农民创产增收等也具有重要的意义。目前，我国果酒产业处于高速发展期，但是果酒的酿造技术仍未形成统一的行业技术标准。果酒的色泽是影响消费者购买的重要因素，然而果酒色泽不稳定的难题制约着果酒行业的发展[2]。目前仍未探索出高效的稳定果酒色泽的生产技术和相应的评价标准。在发酵型果酒生产实践中，专家发现完全照搬葡萄酒的酿造方法行不通[3]，不能突显水果自身独特的优势，这与各种水果的营养成分比例、花色苷种类、含水量、酸甜度不同，因此酿造的果酒品质也不同有关。酿造发酵型果酒时，必须根据各种水果不同特性，优化其酿造技术，进而得到质量优良的特色酒品。此外，酒体品质不稳定的情况严重制约着果酒行业发展，如何保证果酒品质在货架期和贮藏期的稳定，使色泽保持均一不变，改善果酒出现降解沉淀、酒色褐变损失等现象[4]，成为果酒产业亟待解决的一大难题。

花色苷广泛存在于水果之中，是影响果酒色泽的最重要因素之一，在酿造和储存过程中，花色苷会发生一系列变化，从而影响果酒颜色及其功能活性[5]。花色苷的形态及浓度直接影响果酒的色度、色调及稳定性。但是由于花色苷极其不稳定，其在复杂的工艺过程中容易受到pH、温度、光照、酶、糖及其降解产物、二氧化硫、金属离子以及微生物等多种因素的影响而发生降解，进而影响酒体的色泽和功能活性[6]。其中，酵母发酵是花色苷及其衍生物的重要影响因素，不同发酵工艺对花色苷的衍生物影响不同，发酵过程中微生物的代谢产物也会影响花色苷的稳定性。在发酵和陈酿过程中，采取一些物理手段或是添加外源物也会显著改变酒体色泽。此外，果酒在完成酿造工序再经过一系列的过滤澄清之后，在储藏、运输、销售过程中，可能受到光照、温度等因素的影响，也会出现变色、褪色、沉淀的现象[7]。目前的果酒生产技术手段仍不能保证优质果酒高效化生产，制约了果酒产业高质量发展。

本文主要综述了发酵型果酒色泽变化现象，归纳了花色苷在果酒中的不稳定现象、原因以及改进方法，明确了果酒中花色苷的降解、聚合等规律，提出了现有的提高花色苷稳定性的技术手段，以期为提高发酵型果酒的花色苷稳定性提供一定的理论依据，促进果酒规范化、工业化生产，最终推动果酒产业高质量发展及果酒色泽行业质量标准的形成。

1 富含花色苷的果酒色泽衰减现象

富含花色苷的果酒色泽是影响感官评定和评判分析果酒质量的重要指标之一。果酒色泽反映了水果的品质、酿造的工艺、水果原产地情况以及陈酿时间等，还能体现其风味、酒龄、口感及功能活性。

在酿酒酵母发酵过程中，果酒的亮度（lightness,L*）、红绿度（a*）、黄蓝度（b*）、色相角（hue,hab）、饱和度（chroma,C）、色密度（color density, CD）、色度（tint,T）等会随着各种生化反应的发生而发生改变。在发酵前期，果酒色泽主要由单体花色苷的种类和浓度决定，随着发酵的进行，花色苷会出现降解、聚合等反应，这时酒体色泽主要由花色苷化合物及其衍生物决定[8]。HORNEDOORTEGA 等[9]研究发现草莓原液经过发酵后，花色苷类物质损失了19%，酒体颜色由红色变成橙色。草莓果酒中花色苷含量较少，随着陈酿时间的推移，酒体容易消褪至无色，降低草莓酒的感官体验好感。吴梦[10]研究发现桑葚酒在酵母发酵过程中，L*、C、a*、b*值迅速上升后下降，总花色苷的含量急速下降至保持平稳。刘虹[11]研究发现，蓝莓酒在发酵过程中颜色变化呈现出一定的规律，发酵初期蓝莓酒呈现鲜艳的紫红色，随后逐渐往浅色方向褪变，中期出现浑浊物，后期颜色逐渐变暗，变成深红玫瑰色。根据实验数据分析，发酵前期果酒中花色苷单体被存在的二氧化硫还原了部分花色苷，导致酒体颜色褪去；发酵后期单宁、蛋白质等物质溶出，导致酒体聚合色度增强；此外，溶出的一些氨基酸、蛋白质、醛酮类物质与还原糖反应，生成褐色聚合物，导致酒体颜色往黄色调方向转变，而加入二氧化硫可以抑制褐变反应发生。LIU等[7]研究也发现，新鲜蓝莓酒呈现鲜艳的蓝紫色，随着陈化时间的延长，逐渐变成砖红色，影响消费者的感官体验。

富含花色苷的果酒在储藏阶段也会出现色泽变化，有些花色苷含量少的果酒在经过一段时间的储存之后，会出现酒色全部丢失的情况。SOKÓŁŁĘTOWSKA等[12]研究了含10种不同水果利口酒的花色苷活性，结果表明在15 ℃和30 ℃温度条件下储藏6个月，利口酒中的花色苷均降解消失。此外，果酒经过长期储藏之后会出现云雾状或是片状沉淀，从而破坏酒体平衡，影响花色苷结构稳定性，果酒颜色随之发生改变，这种变化在桑葚酒和葡萄酒中尤为常见。GAMBUTI等[13]发现桑娇维塞葡萄酒的晶体沉淀主要是槲皮素，控制陈化环境中氧气浓度能有效减少该沉淀的产生。桑葚酒在刚酿造完成时呈现紫红色，而经过长时间的陈化储存，酒的颜色会向砖红色转变，甚至变成黄色[14]。ZHANG等[15]研究发现，在4 ℃、25 ℃和37 ℃条件下，贮藏时间对杨梅酒的L*、a*和b*值均有显著影响。L*值在贮藏前10 d 内急剧下降，随后保持不变，而a*和b*值则逐渐下降。LI等[16]研究发现，蓝莓酒在25 ℃的暗箱中贮藏4 周后，参数L*、a*、b*、hab、CD 值逐渐下降，导致储藏后的蓝莓酒与刚酿造完成的蓝莓酒有明显的色泽差异，而T值随着贮藏时间的延长而增大。BENUCCI[17]发现玫瑰红气泡酒在30 ℃的黑暗处贮藏9 个月，其红色消失殆尽，最后酒体呈现黄色调。

2 影响果酒色泽变化的因素

果酒色泽是预判酒龄和品鉴酒品的依据。果酒色泽发生变化一方面是因为酒体经过长时间的陈酿熟化，生成了各种衍生物；另一方面是由于品质的劣变衰减或不稳定导致沉淀产生[18]。酒体是一个复杂的体系，酒色与多种成分（如单宁、槲皮素、黄酮醇等）相关联，其中主要的呈色物质是花色苷，果酒中花色苷的含量取决于花色苷的溶出率以及降解率[19]。在果酒酿造和贮藏的过程中，体系变化导致花色苷发生了一系列的变化。一是酵母带来的影响：酵母细胞壁会吸附花色苷，另外，在酵母的生长繁殖过程中，也会释放出一些酶来催化花色苷降解[20]。二是花色苷本身对外界因素的敏感性：如花色苷在热作用下会发生水合作用，从而发生开环反应生成查尔酮；花色苷吸收光能会转变成激发态离子，进而与醌类物质发生缩合、聚合反应，生成褐色产物，甚至黑色素；花色苷酶促降解、花色苷被金属催化发生络合反应等都会使果酒的色泽组成发生重要变化[21]。三是其他物质与花色苷相互作用：水果的其他成分（如蛋白质、酒石酸、单宁等）溶出到酒体中，长期共存于果酒中会产生胶体和沉淀[22]。

2.1 酵母的吸附作用

酵母的生命活动对果酒中的花色苷稳定性影响很大。在发酵前期，酵母产生的酒精能极快地提高花色苷的溶出率，增强果酒色泽。但同时酵母细胞壁对花色苷具有不同程度的吸附作用。BOŽIČ等[20]研究了95 种酵母和非酵母菌株对花色苷的吸附能力，发现所有菌株的细胞壁均对花色苷和吡喃花色苷有一定的吸附力，吸附率最高达到9.1%。王建栋[23]发现啤酒酵母对花色苷的吸附量随时间延长而增加。ECHEVERRIGARAY 等[24]研究表明，在葡萄酒发酵过程中，活酵母对花色苷的吸附性不强，而在酒精发酵末期，对花色苷吸附能力强的菌株积累了花色苷。可见，花色苷的吸附与细胞存活率和细胞膜完整性呈负相关。酵母对花色苷的吸附需要突破细胞壁的内部，酵母死亡后的碎片会与花色苷发生凝聚反应，从而降低酒中花色苷的浓度。研究表明，酵母对花色苷和乙烯基花色苷的吸附率较高，但是其中的5-羧基吡喃花色苷保留较多[9]。

2.2 酵母代谢产物的影响

在发酵过程中，酵母为获得能量进行生长繁殖，会先将葡萄糖转化为丙酮酸，再进一步把丙酮酸代谢成乙醛[25]。这一过程中释放出的乙醛、丙酮酸和乙烯酚基等副产物会促进简单花色苷向花色苷衍生物转变。刘书晶[26]发现桑葚酒陈酿完成后，酒体中单体花色苷含量下降了92%以上，取而代之的是2 种花色苷衍生物——儿茶酚吡喃矢车菊素-3-葡萄糖苷和儿茶酚吡喃矢车菊素-3-芸香糖苷，同时，酒体色度下降而色调（色相角）上升。单宁和花色苷之间通过乙基键形成的聚合反应对于稳定红酒颜色非常重要。在葡萄酒陈酿过程中，乙醛充当花色苷与单宁缔合的键桥，促进了花色苷衍生物的形成[27]，导致结合态的花色苷增多，酒体颜色加深。乙醛在花色苷分子上进行环加成后会形成吡喃花色苷Vitisin B[28]。此外，乙醛还介导花色苷与儿茶素或表儿茶素生成缩合产物，由甲基甲川桥连接[29]。在酒体成熟过程中，锦葵素-3-葡萄糖苷C4和C5位上的羟基与烯醇化形式丙酮酸的双键发生环化反应，然后经过脱水作用和再芳构化反应生成羧基吡喃花色苷Vitisin A[30]，此反应过程中需要有一定量的活性氧存在[31]。TENG 等[32]发现：在含有乙醛和锦葵素-3-葡萄糖苷的模型酒中添加从葡萄皮中提取的单宁，可以与花色苷形成复合物，在体系中维持平衡而不沉淀；而添加从葡萄籽中提取的单宁后，容易聚集形成沉淀而导致酒体颜色褪减。

2.3 生物酶的影响

酶促反应是影响红酒颜色的重要因素。酶促氧化由氧化还原酶（如多酚氧化酶、过氧化物酶等）催化，它们将酚类化合物降解为黄色、棕色或黑色色素，导致酒体色泽衰减。此外，果胶酶可以破坏葡萄皮的细胞壁，促进单宁和花色苷的释放以增强红酒色泽的稳定性[33]。GENERALIĆ MEKINIĆ等[34]研究发现在巴比卡（Babica）葡萄酒浸渍过程中添加复合酶，可以促进花色苷溶出到酒中。酵母在生长繁殖过程中产生的β-葡萄糖苷酶也可以切割糖苷键以释放花色苷的苷元，而苷元不稳定，会自发转化为无色和棕色的化合物。β-葡萄糖苷酶活性和细胞壁的吸收特性都是不同种属酵母菌种的特异性特征，因此，菌种类别是影响酒体颜色的重要因素[35]。另外，有的酵母具有羟基肉桂酸脱羧酶的活性，在发酵和老化过程将果酒中的羟基肉桂酸类酚酸水解物转化为乙烯基苯酚[36]，进而与花色苷缩合形成羟苯基（酚基）吡喃花色苷。

2.4 金属离子的影响

金属离子的种类和浓度也会影响酒体颜色。虽然金属离子可以在一定程度上优化果酒色泽，但是过高的金属离子浓度会影响果酒风味，因此需要适当控制果酒中的金属离子浓度。SUN 等[25]发现在低铜离子浓度下，葡萄酒中几乎所有的多酚类物质浓度和抗氧化活性增加。当铜离子浓度在较高的范围（32、64 和96 mg/L）时，葡萄酒的多酚含量、CIElab 颜色参数和抗氧化活性都显著下降。CZIBULYA 等[37]发现：温度对红葡萄酒的色泽强度影响很大，而对色调影响不大；而当往红酒中加入钾盐后，可以观察到酒的色泽强度增大，当钾离子的添加量约为0.5 g/dm3时，色泽强度达到最大，且较高的钾离子浓度可以减弱温度对色泽强度的影响。

2.5 氧气的影响

在果酒的陈化过程中，氧气的存在会影响花色苷的演变，低浓度的氧气对果酒色泽呈现积极的作用，而过高浓度的氧气则会导致酒体不稳定。ZHANG 等[38]研究发现，杨梅酒瓶中过量的氧气加速了花色苷的降解，导致酒体颜色褐变。而二氧化硫的存在可以消耗瓶中的氧气，保护红酒中的花色苷[39]。ONTAÑÓN 等[40]发现相较缺氧条件，微氧环境使红酒的色泽强度提高了4～5倍，原因是在有氧环境下，黄烷醇的C4正离子产生乙基键连接单宁-花色苷，促进了吡喃花色苷的形成。SÁNCHEZGÓMEZ 等[41]发现在适量氧气处理下，高氧合率的桶中陈酿的葡萄酒能更快、更多地消耗氧气，在一定程度上增加了葡萄酒的色泽强度。

2.6 温度和光照的影响

果酒中花色苷的稳定性在很大程度受到外界温度和光照的影响。STÁVEK等[42]研究发现相较于在3 ℃条件下贮藏，在室温下贮藏的玫瑰红葡萄酒中花色苷含量降低了50%，将贮藏温度提高到45 ℃，花色苷则全部分解。IFIE 等[43]发现相较在30 ℃条件下陈酿12个月，在6 ℃条件下陈酿的玫瑰茄酒颜色密度最高。LAN 等[44]研究发现紫外光和白光均对梅丽葡萄酒色泽有一定的负面影响，尤其在铁离子存在的情况下，会发生光助芬顿反应，从而导致酒体色泽不稳定。LIU等[45]发现在模型酒溶液中，随着温度升高，花色苷的降解反应速率常数（K）变大，半衰期缩短。

2.7 沉淀的影响

沉淀会影响酒体平衡和导致酒色衰减，以致酒品感官质量下降。水果的酒石酸在酒精中的溶解度比在果汁中的溶解度低，会和钾离子结合生成晶体沉淀——酒石酸氢钾，其在结晶的过程中会吸附部分花色苷。水果及其发酵过程中，微生物菌体自溶产生的蛋白质与单宁紧密结合，可出现蛋白质-单宁絮凝状沉淀。李亚辉等[46]研究发现，草莓酒中的沉淀主要由蛋白质与色泽呈现的物质组成，沉淀增多会导致酒的色泽消褪。LIU等[45]研究发现在酒样模型中，花色苷聚合遵循零级反应动力学，且温度的升高会使花色苷聚合物生成速率更快。TENG等[47]发现，酒体沉淀随着单宁分子量和乙醛浓度提高而增加，花色苷的乙基和乙烯基衍生物也容易聚合形成沉淀。SOMMER等[48]发现，多酚-蛋白质-多糖相互作用使得酒体电荷不平衡，导致模型酒体产生浑浊。

酒体中花色苷的变化情况复杂，花色苷衍生物的生成途径仍未清晰，因此，人们常构造合适的果酒模型，通过筛选酵母或外加辅色剂、酒体改良剂调控酒体环境以保持花色苷动态平衡，避免后沉淀现象的出现，保证在储藏期间果酒色泽均一、稳定。

3 提高富含花色苷果酒色泽稳定性的方法

研究人员正广泛尝试采取不同的物理化学以及生物方法使花色苷在发酵、陈酿、澄清过程中保持稳定。比如优化果酒的发酵条件，选择适宜的澄清剂、稳定剂，改进果酒陈化条件，以达到预防花色苷分解，保护酒体色泽稳定的目的。

3.1 物理方法

物理方法主要是通过机械力迫使水果细胞中的花色苷更多地溶出，促进花色苷自缔合，达到保持花色苷稳定性的目的。另外，很多物理方法对水果中的多酚氧化酶和过氧化物酶具有钝化作用，对花色苷也起到了一定的保护作用。目前常用的物理方法有浸渍、冷冻、超声、脉冲电场（pulsed electric fields,PEF）、微波等。

LIU 等[49]发现，经过8 d 的浸渍可以提高桑葚酒游离和聚合花色苷总量，使得果酒呈现出较深的红色，但是酒的果香及整体口感都下降了。GONZÁLEZ-ARENZANA 等[50]发现，采用二氧化碳浸渍法生产的丹魄（tempranillo）红葡萄酒相较标准法生产的而言，前者酒体中花色苷的香豆酰基衍生物、Vitisin A、Vitisin B的含量更高，因此具有较高的色泽强度。曲一鸣等[51]发现在8 ℃环境下冷浸渍赤霞珠葡萄8 d，能有效提高酒体的酚类浓度，降低酒体pH，使葡萄酒呈现鲜亮饱和的红色。张嘉璇等[52]发现对‘黑比诺’葡萄进行预冷冻处理，可以破坏葡萄细胞的膜，促进果皮中的花色苷更多地溶出到酒中。吉俊臣[53]发现采用超高压、超声波、微波处理均提高了蓝莓酒的色泽亮度，营养成分也能得到很好的保留。PÉREZ-PORRAS等[54]发现，超声处理对红酒色泽有积极作用，与直接浸渍7 d 酿造的葡萄酒色泽相比，超声处理72 h就可以达到同样的色泽效果，但采用超声处理可以缩短一半的酿造时间。LI等[16]采用低频超声技术处理陈化阶段的蓝莓酒，处理后果酒的色彩参数L*、a*、b*、hab和C值都上升，而且对酒的抗氧化能力没有影响。

脉冲电场处理可在细胞膜上形成孔，加快花色苷溶出过程。LEONG 等[55]发现在采用高能量PEF处理梅洛葡萄时，可以即刻提取出大量的花色苷，且其色泽强度高，在一段时间内能保持稳定。对罗蒂内拉（Rondinella）葡萄进行10～20 kJ/kg 强度的PEF预处理，可以在不影响葡萄酒发酵演化，也不改变酒体中的基本成分和金属含量的前提下，相较添加果胶酶而言，提高了酒体中花青素和单宁的含量，进而提高了红葡萄酒的色泽强度。罗蒂内拉葡萄酒经12个月的储藏后，聚合色素和Vitisin A含量提高，并表现出较好的色泽稳定性[56]。

果酒在装瓶前需要用澄清剂进行处理，以减少引起花色苷沉淀的蛋白质等物质，使酒体保持稳定。澄清剂的种类和剂量也是影响果酒稳定性的关键因素。GHANEM等[57]研究发现：采用膨润土和聚乙烯基聚吡咯烷酮、酪蛋白酸钾分别对红酒进行澄清处理，对酚类成分的影响较大，降低了花色苷和单宁的浓度；而使用植物蛋白和明胶对红酒进行澄清处理，对酚类物质含量影响较小。李亚辉等[46]发现，采取600 mg/L的皂土下胶并进行冷冻处理草莓酒，可使草莓酒在12个月的贮藏期内保持较高澄清度，使酒体色度变化减小。

3.2 化学方法

化学方法主要是辅色分子通过非共价力或氢键与花色苷形成复合物，维持花色苷基团结构稳定性，主要分为分子间辅色、分子内辅色、自聚辅色以及金属络合。现阶段研究较多的辅色因子有多酚、多糖、酵母提取物等。

多酚中研究较多的是酚酸类化合物。花色苷与酚酸类物质相互作用，具有增强葡萄酒色泽，提高颜色稳定性的效果。ZHU 等[58]研究发现，3 种酚酸（阿魏酸、芥子酸和丁香酸）能自发对杨梅花色苷产生辅色作用，CIElab 颜色参数表明，随着络合色素浓度增加，花色苷模型水溶液吸光度增加，L*减小，a*增大，经处理后没有新的花色苷衍生物出现，热稳定性显著提高。其中，芥子酸与杨梅花色苷相互作用能形成更稳定的络合物，辅色作用效果最好。FAN 等[59]发现，酚酸类化合物在黑莓酒渣花色苷溶液中表现出较好的辅色作用，在50～70 ℃温度范围内呈现较好的色泽、热稳定性和光稳定性，而在90 ℃时花色苷降解速率加快；黄酮类化合物提高了黑莓酒渣的氧化稳定性。在所有酚酸中，阿魏酸的辅色效果最好，在黄酮类化合物中芦丁的活性最高。分子结构模拟技术分析结果表明，芦丁和阿魏酸的体积最大，势能最大，能量和范德华力最小，有利于花色烊盐阳离子的稳定，辅色机制涉及氢键、π-π堆积和溶剂影响。ZHANG等[60]评估了香豆酸、阿魏酸和咖啡酸对红酒模型颜色呈现的影响，结果发现，3种羟基肉桂酸都有一定的辅色作用，辅色作用的强弱不仅与分子浓度有关，而且与辅色因子的分子结构有关，其中甲氧基或羟基数量更多的阿魏酸与锦葵素-3-葡萄糖苷相互作用形成更稳定的配合物，从而使红酒色泽更稳定。LIU等[61]在越橘糖浆酒的陈化过程中，添加从五倍子中提取的没食子酸和单宁酸，发现对单体花色苷有辅色作用，减少了聚合花色苷的生成，延缓了酒体红色的消褪，抑制了明度、色度和黄度的增加。李永强等[62]研究了黄酮对杨梅酒中花色苷的辅色作用，证实了黄酮的含量、花色苷含量与色调值呈极显著正相关的结论。

另外，某些多糖以及酵母提取物等对果酒颜色稳定性具有一定的积极作用。研究发现，果胶多糖通过静电作用力和疏水作用力和花色苷结合，以提高花色苷热稳定性和pH 稳定性[63-64]。另有研究表明，添加糖类物质可以防止黑莓汁中的花色苷受热降解，其中海藻糖对黑莓汁花色苷的保护作用最大[65]。SUN等[66]发现，蓝莓酒中添加酵母提取物——甘露糖蛋白能在发酵和陈酿过程中保持花色苷的稳定性，降低蓝莓酒的L*值，提高a*和b*值，有利于蓝莓酒色泽的稳定性，并呈现剂量依赖性。推测甘露糖蛋白这种蛋白质大分子物质可以“包裹”花色苷，也可能是其本身带的负电荷与花色苷形成了静电体系。

值得注意的是，添加不同的辅色因子对果酒均有辅色作用，但每种辅色因子的结构、作用力、所处的果酒环境不同，因此需要更深入分析不同花色苷的辅色机制。

4 小结与展望

果酒体系成分复杂，花色苷是其中重要的呈色物质以及功能活性物质。本文从影响果酒色泽的因素花色苷及其衍生物入手，对影响果酒色泽变化的因素（酵母的代谢、金属离子、温度和光照等）进行了分析，并阐述了目前国内外为改善产品色泽稳定性采用的物理、化学方法等。花色苷在酒体中的降解机制还未完全阐明，护色的技术手段仍未成熟，采取更先进的技术手段理清各种因素对花色苷稳定性作用规律极其必要。

在未来，可以通过分子对接、圆二色谱、旋光仪、紫外光谱、红外光谱、荧光光谱等技术和手段研究花色苷与多酚、蛋白质、多糖等的互作机制；借助代谢组学和蛋白质组学等技术筛选稳定富含花色苷果酒色泽的酿酒酵母；利用高效液相、二维核磁共振谱等多谱学技术解析花色苷在发酵、陈酿以及贮藏期间的结构、色泽和活性变化规律。此外，应加强对护色菌种的筛选、护色机制的阐明、花色苷色泽稳态构效关系的解析等基础研究，开发更多利于果酒色泽稳定的物理和化学手段，以期为水果深加工产业打开新思路，也为我国高端果酒行业的发展奠定基础。