外泌体在神经退行性疾病中的作用

许鹏飞综述， 张红菊，2审校

神经系统退行性疾病发病率逐年上升，仍缺乏修饰性治疗策略。外泌体是一种由活体细胞通过胞吞-胞吐方式释放的小囊泡，具有细胞通讯作用，在神经系统退行性疾病的发生、发展过程中具有重要作用；因此，在疾病的早期诊断和治疗上具有重要研究价值。本文针对外泌体与神经系统退行性疾病相互关系的研究综述如下。

1 外泌体概述

1983年，Pan和Johnstone团队首次在绵羊网织红细胞成熟过程中，发现了一种与转铁蛋白释放到细胞外途径相关的小囊泡，并于1989年定义为外泌体[1]。最初，外泌体被认为是一种清除细胞代谢废物的运输工具，越来越多的研究表明，外泌体在细胞通讯过程中起重要作用，能够反映并影响细胞的生理、病理状态，其中某些分子成份与疾病的发生、发展、治疗有密切联系[2]。

1.1 外泌体的释放 细胞外囊泡根据其直径大小可分为三种，分别为凋亡小体(50～5000 nm)、微泡(100～1000 nm)、外泌体(30～150 nm)。外泌体与细胞凋亡过程中产生的小囊泡不同，外泌体只能由活细胞分泌，且能被体内多种类型细胞分泌，广泛存在于各种体液中[3]。外泌体通过胞吞-胞吐方式由亲本细胞释放；首先，胞膜内化形成胞内体，胞内体聚集形成多泡体(Multivesicular Bodies，MVBs)，MVBs与亲本细胞膜融合，通过胞吐作用将外泌体排出细胞。多种因素通过不同途径影响外泌体释放，小GTP酶蛋白的 RAB 家族(RAB27、RAB5A、RAB9A、RAB2B、RAB11、RAB35)通过影响MVBs膜与细胞膜的融合促进外泌体分泌[4]。

1.2 外泌体的通讯作用 外泌体与靶细胞交流通过以下方式：(1)外泌体膜与受体细胞膜相互融合，释放所携带物质进入受体细胞。(2)通过配体受体之间相互作用激活信号通路。(3)细胞通过胞吞作用将整个外泌体内化后，与溶酶体融合，将所携带物质释放入受体细胞。此外，内化后的外泌体还可以与MVBs融合，再次被分泌出细胞外[5]。

1.3 外泌体的组成 外泌体由构成性分子和运载分子共同组成，构成性分子取决于释放外泌体的亲本细胞种类，其外侧双层膜结构主要成分为脂质和蛋白质。外泌体的构成及运载分子包括RNA、脂质及蛋白质，其中蛋白质包括四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)、Flotillin、Alix、TSG101、和热休克蛋白 (Hsc70、Hsp90) 等[6]，四次跨膜蛋白常被作为外泌体鉴定标志物。Flotillin主要用于膜蛋白之间的相互交流与信号转导，研究表明Flotillin可作为阿尔兹海默病(Alzheimer disease，AD)诊断的新型标志物[7]。外泌体还携带有mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA，并转移至其它细胞中发挥生物学调控作用，成熟miRNA的一条单链可与某些蛋白质相互作用，形成RNA诱导沉默复合物(RISC)[8]调节蛋白质表达。不同外泌体的运载分子不尽相同，这与外泌体亲本细胞和外泌体形成过程中各种生理和病理条件有关。

2 外泌体与神经系统退行性疾病

2.1 外泌体与α-突触核蛋白病 α-突触核蛋白(α-synuclein，α-syn)是大脑中大量存在的一种可溶性蛋白质，尚不明确其健康状态下的功能，但错误折叠和纤维状聚集的α-syn沉积在中枢及周围神经系统中将导致一系列α-突触核蛋白病发生，如帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、路易体痴呆(Dementia with Lewy bodies，DLB)等。PD是仅次于AD的第二大类神经系统退行性疾病，65岁以上人群发病率为2%[9]。其病理特征是α-syn构成的路易小体(Lewy Body，LB)在神经元胞体和轴突内沉积[10]。目前认为神经元功能受损甚至死亡是由α-syn寡聚体引起的。α-syn可被分装入外泌体释放到细胞外环境，导致类似于朊病毒样的病理传播。实验发现，PD患者血清外泌体中α-syn含量多于正常对照组[11]，且α-syn以寡聚体形式存在于血清外泌体中；但PD患者脑脊液总α-syn含量低于正常对照组，可能是中枢神经系统由于某种保护机制向血液系统中转运α-syn增加，其具体机制需进一步研究。将PD患者血清外泌体接种细胞，可致其表达α-syn单体及寡聚体增加；且用PD患者脑脊液外泌体接种健康小鼠，会使小鼠脑脊液中α-syn的表达水平呈剂量依赖型增加[12，13]，故PD患者血清和脑脊液外泌体可以促进靶细胞中α-syn形成。依赖于完整的外泌体传播途径，与游离α-syn相比，外泌体中α-syn更容易被受体细胞内化，在神经系统传播中，毒性更大。

外泌体形成和分泌过程受自噬-溶酶体途径(ALP)调节。ALP异常时，蛋白质清除能力下降，并影响PD及DLB的发生发展；ALP受损将导致细胞内α-syn寡聚体的清除效率降低，引起α-syn寡聚体向细胞外释放增加，导致外泌体中α-syn寡聚体在细胞间传播，加速疾病进展[14]。

小胶质细胞被认为是传播α-syn寡聚体导致PD进展的潜在载体。用α-syn处理BV-2小鼠小胶质细胞，发现α-syn可以诱导小胶质细胞分泌外泌体增加，将此外泌体与神经元细胞共培养可致神经元细胞凋亡增多，说明外泌体在小胶质细胞介导PD的进展过程中扮演重要角色[15]。将DLB患者脑组织的外泌体接种细胞，可观察到α-syn在细胞中聚集[16]，接种至健康小鼠大脑中，会导致α-syn在神经元细胞中聚集[17]，说明DLB患者脑组织源性外泌体可使DLB病理播散，加重病情。研究发现，处于进展期的DLB患者脑脊液外泌体α-syn水平较高，且α-syn含量与MMSE得分呈负相关[13]，这表示DLB患者脑脊液外泌体α-syn含量可能与疾病活动有关，且影响患者的认知水平。虽然PD患者脑脊液外泌体接种小鼠会导致小鼠脑脊液中α-syn含量增加，但尚未观察到PD患者脑脊液外泌体α-syn含量与UPDRS分期的相关性。

2.2 外泌体与AD AD的病理特征为β-淀粉样蛋白(Amyloid β-protein，Aβ)沉积形成神经炎性斑，及过度磷酸化Tau蛋白在神经元内形成神经原纤维缠结。AD患者的病理斑块中有大量的Aβ及外泌体特定标志蛋白Alix存在，Rajendran等发现Aβ可通过外泌体分泌至细胞外，并证实了外泌体具有在细胞间传播毒性Aβ和高磷酸化Tau蛋白的能力，当外泌体途径被阻断可减弱Aβ聚集和传播[18，19]。有研究报告：小胶质细胞减少可以抑制Tau蛋白增殖，小胶质细胞外泌体合成受到抑制，可降低Tau蛋白的繁殖与传播[20]，这说明小胶质细胞外泌体在AD的发生发展中同样具有重要研究价值。另有研究发现：轻度至重度(Braak 3-6期)的AD患者，脑脊液外泌体中磷酸化Tau蛋白浓度显著高于早期阶段(Braak0-2期)[21]，这表明外泌体相关的磷酸化Tau蛋白与疾病的进展有关。

3 外泌体在神经系统退行性疾病中的应用价值

外泌体存在于各种体液中，便于获得，其成分特异，所携带物质不仅能反映亲本细胞的生理和病理状态，并且外泌体可保护其携带的miRNA、蛋白质等稳定存在，不被核酸酶和蛋白酶降解，因此，可成为神经系统退行性疾病的诊断重要标志物；因其具有穿过血脑屏障的功能，对其进行修饰、装载，将成为药物治疗的载体，可在神经系统退行性疾病的治疗中发挥重要的作用。

3.1 外泌体与神经系统退行性疾病的诊断 神经系统退行性疾病起病隐匿，早期无明显临床症状，但生物特性的变化已经在外泌体中体现，因此，外泌体的改变可为疾病早期诊断提供依据。目前PD的诊断多依赖于临床症状，但当纹状体中70%至80%和黑质中50%的多巴胺能神经元丢失时[22]，才出现运动症状，因此，PD早期诊断的生物学标志物有待进一步明确，人们正在尝试从脑脊液、血液、尿液中提取外泌体及外泌体携带物质进行PD早期诊断的探索。

与脑脊液相比，血液和尿液样本更易获得，但外周血中血小板和红细胞会产生大量的α-syn，若制备样本时发生溶血则影响血浆外泌体中α-syn检测结果。在PD患者尿液外泌体中可检测到与PD相关的LRRK2蛋白[23]，但由于LRRK2在人体内表达多变，不能得到稳定的检测结果，因此不能用于PD的早期诊断。DJ-1是一种由189个氨基酸构成的蛋白质，具有抑制α-syn聚集的作用，有研究发现男性PD患者尿液外泌体中DJ-1与正常人存在明显差异[24]，但研究样本量较小，能否成为未来诊断标志物仍需进一步验证。

脑脊液可直接反映脑内病理变化，故使用脑脊液外泌体样本对疾病诊断更精确，但不易获得。对脑脊液外泌体miRNA分析发现PD患者脑脊液外泌体较正常对照组有16个miRNA表达上调，11个miRNA表达显著下调，而miR-153、miR-409-3p、miR-10a-5p显著过度表达[25]，这些差异有望成为PD早期诊断标志物。

Aβ在脑内沉积是一个长期缓慢过程[26]，对AD临床前期诊断有助于早期干预疾病发生发展。研究表明AD患者血浆脑源性外泌体中总Tau蛋白、P-T181-tau、P-S396-tau和Aβ1-42水平均显著高于正常对照组，在认知正常的高危患者中可检测到磷酸化Tau蛋白、P-S396-tau和P-T181-tau，这些改变可追溯到AD诊断的10 y前。动态检测发现，从临床前的高危人群到AD确诊，患者血浆外泌体Aβ1-42水平由逐渐升高到显著增高[27]，因此，血浆外泌体Aβ1-42具有刻画AD进展的价值。

外泌体的标志蛋白Flotillin是位于外泌体脂筏上的疏水性蛋白，可通过影响Ca2+稳态、线粒体功能参与AD的发病。一项临床研究发现：与非AD人群相比，AD患者脑脊液和血清中Flotillin水平显著下降，用11C-匹兹堡化合物B (11C-PiB)正电子发射断层摄影(PET)成像技术分析Aβ沉积，发现血清Flotillin水平与Aβ沉积负相关[28]，这表明血清Flotillin水平可用来评估Aβ沉积，可用于早期诊断。

3.2 外泌体与神经系统退行性疾病的治疗 外泌体经改造后可回输至自体，减少因药物载体带来的免疫反应，提高治疗的安全性，且由于其能够通过血脑屏障，故可用外泌体作为药物载体对神经系统退行性疾病进行靶向治疗。中国研究团队通过饱和溶液孵育法，成功有效的将多巴胺装载入血浆外泌体中，通过动物实验证实，装载入血浆外泌体的多巴胺透过血脑屏障，被成功传送至大脑的黑质和纹状体，且多巴胺在脑内分布增加了15倍以上[29]。有研究团队将过氧化氢酶(强效抗氧化剂)在不改变外泌体结构的情况下装载入外泌体，携带过氧化氢酶的外泌体透过血脑屏障，富集在神经元细胞和小胶质细胞[30]，发挥强大的保护作用。此外，有研究将抗α-syn的shRNA微环(shRNA-MCs)装载入被狂犬病毒糖蛋白肽修饰过的外泌体(RVG-exosome)，并通过尾静脉接种PD小鼠，发现PD小鼠脑中α-syn表达减少、聚集水平降低，且黑质致密部多巴胺能神经元丢失减少，临床症状改善[31]。最近有研究将含有中性内肽酶(NEP)和胰岛素降解酶(IDE)活性的间充质干细胞外泌体注射AD模型小鼠，发现小鼠的Aβ斑块沉积减少[32]。Wang H等将姜黄素(curcumin，cur)诱导的外泌体(exosome-cur)注射入冈田酸(Okadaic Acid，OA)诱导Tau过度磷酸化的AD小鼠，观察到exosome-cur可以通过AKT/GSK-3β通路抑制Tau蛋白的磷酸化[33]，且小鼠的认知功能得到改善。上述的研究结果将为PD、AD及其他神经系统退行性疾病的治疗提供新的方法。

4 小 结

随着人口老龄化加剧，神经系统退行性疾病发病率越来越高，给患者、家庭及社会带来巨大影响，探究其病理，对其进行早期诊断、早期干预成为当下解决问题的重点。对外泌体进行探索发现其与神经系统退行性疾病有巨大联系，虽然目前仅在研究阶段，实际应用还面临诸多困难，但其仍不失为一种有前途的方法。