蓝莓提取物对改善小鼠睡眠剥夺型记忆力减退的影响研究

杨闯，潘顺圆，刘鑫悦，李震东，杨帆，裴娜，孙磊，任永宁，孔凡志

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

在哺乳动物中，睡眠是一种既普通又异常重要的生理过程。哺乳动物的睡眠呈现周期性、可逆性和自发性等特点。已有研究证实，良好的睡眠对于动物体的多种机能具有恢复作用，包括记忆巩固、增强免疫力和记忆力巩固等。大量的动物实验和流行病学调查结果显示，睡眠缺乏可引起过度嗜睡、内分泌紊乱、认知功能下降和增加患心脑血管疾病的风险等[1]。因此，保证充足的睡眠对与动物机体发挥正常生理功能至关重要。但是，随着现在生活节奏的不断加快，成人和儿童的夜间活动时间显著增加，睡眠时间明显减少，不同程度的出现了睡眠剥夺的现象。睡眠剥夺是指由于环境或自身原因无法满足正常睡眠，表现为睡眠减少或睡眠的连续性中断，长期睡眠剥夺很容易导致行为水平下降、注意力不集中、记忆力丧失和学习能力下降等反应[2]。睡眠剥夺作为普遍而强烈的应激源，可以诱导机体产生氧化应激反应和内质网应激反应，严重的可以导致细胞凋亡，进而改变血脑屏障的通透性诱发严重的神经损伤[3-4]。2019年度中国青少年儿童睡眠健康白皮书数据显示，中国青少年儿童睡眠低于标准时间，睡眠不足已成为常态：越睡越晚，越起越早，睡眠时间越来越少；睡眠困扰较多，入睡困难、张口呼吸等问题相对突出；中学生群体发生较多。有研究表明，睡眠剥夺可对身体健康造成不同程度的影响，但睡眠剥夺对记忆力影响的机理研究仍然有限[5-6]。

蓝莓为越桔属植物，果实呈蓝色，其中含有多种生物活性物质，具有很好的保健功能并且拥有极高的药用价值[7]。蓝莓中富含的原花青素和花青素在机体抗氧化、减少炎症、降低DNA 损伤和抗细胞凋亡等诸多方面发挥重要作用[8-10]。有研究表明，予以小鼠蓝莓提取物处理8 个月后，与对照组比较，实验组小鼠在Y 迷宫测试中消耗时间显著减少且学习记忆成绩有明显的提升[11]。给19 月龄的老龄大鼠饲喂蓝莓8 周后，其记忆错误次数减少且认知功能提高[12]。应用蓝莓提取物和复合营养素饲喂衰老大鼠，其学习记忆能力以及机体抗氧化功能得到明显的改善[13-14]。然而，蓝莓提取物能否改善青年小鼠由于睡眠剥夺导致的记忆力减退尚不明确。因此，项目应用发明的小鼠睡眠剥夺装置，对4 周龄小鼠进行睡眠剥夺，同时使用蓝莓提取物灌胃，然后采用TM-vision 泰盟水迷路行为学视频分析系统分析其记忆力变化情况。观察、比较蓝莓提取物灌胃对于小鼠睡眠剥夺型记忆力减退的影响，为后续开发改善记忆力减退的药物奠定理论与试验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4 周龄SPF 级雌性昆明小鼠购买自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，小鼠首先在动物房使用标准饲料和饮水自由饮食一周，分组并分笼饲养，饲养环境清洁通风良好。实验涉及的实验动物操作符合黑龙江八一农垦大学动物伦理委员会标准（20180328002）。

1.2 仪器设备与试剂

TM-vision 泰盟水迷路行为学视频分析系统（中国成都）；小鼠用睡眠剥夺装置；蓝莓提取物通过溶剂萃取法获得，纯度为50%，购自西安瑞林生物科技有限公司；细胞培养用PBS 购买自Hyclone 公司（美国）。

1.3 动物分组与蓝莓提取物灌胃

将15 只4 周龄SPF 级雌性昆明小鼠根据体重情况随机分为3 组，对照组、睡眠剥夺组和蓝莓提取物灌胃组，每组5 只。蓝莓提取物灌胃组小鼠予以5 mg·kg-1体重的蓝莓提取物水溶液进行灌胃，每天灌胃一次。对照组和睡眠剥夺组予以等量蒸馏水灌胃，连续灌胃21 d。

1.4 小鼠睡眠剥夺模型的建立

采用我们发明的小鼠睡眠剥夺装置，应用改良多平台睡眠剥夺法，在蓝莓提取物灌胃的第15 天开始对睡眠剥夺组和蓝莓提取物灌胃组小鼠进行18 h剥夺，6 h 恢复休息的睡眠剥夺处理。各组小鼠自造模的第1 天下午6 点开始进入睡眠剥夺箱内进行睡眠剥夺试验，次日中午12 点恢复睡眠，睡眠剥夺造模共计7 d。睡眠剥夺试验期间光照节律为12 h 光照（5：00～17：00）和12 h 黑暗（17：01～4：59）。睡眠剥夺装置为大鼠笼改造的简易睡眠剥夺箱，大鼠笼底部各固定5 个直径约为2.3 cm，高度为5 cm 的圆台形平台，平台材料为PP 塑料，箱内注入清水至距平台顶端约0.5 cm 处左右，保持箱内水温为25±2 ℃，箱上覆盖有铁网，每天定时清洗箱内排泄物并更换箱内的水。

1.5 泰盟TM-vision 水迷路试验

试验开始前，先将小鼠放置于水迷路装置的起点平台处，让其适应水迷路平台环境，时间大约为5 min。然后，将小鼠面壁放置于远离起点平台的固定水域，放手后，小鼠自行寻找至起点平台并登上平台后试验结束，记录小鼠所需时间。蓝莓灌胃期间所有小鼠每天进行5 次水迷路训练，让其形成记忆。从训练的第15 天开始，对睡眠剥夺组小鼠和蓝莓提取物灌胃组小鼠进行睡眠剥夺，睡眠剥夺周期为每天18：00到次日12：00 共计18 h，连续进行睡眠剥夺7 d。在训练的第22 天和第23 天，也就是睡眠剥夺7 d 后，使用泰盟TM-vision 水迷路行为学检测装置检测小鼠搜索平台所需时间是否发生变化。每只小鼠记录6 次登上平台所用时间，取平均值作为最终数据。

1.6 统计学分析

统计学处理软件为SPSS17.0，数据采用单因素方差分析，实验结果以冀±SD 表示，组间比较采用t检验。以P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 睡眠剥夺对小鼠记忆力的影响

在使用泰盟TM-vision 水迷路装置进行记忆力训练过程中，随着训练的天数不断增加，各组小鼠由投放水域自行寻找到起点平台所用的时间逐渐缩短（表1），表明，小鼠经过训练已经对平台的位置产生记忆。然而，自睡眠剥夺开始的第2 天起，与对照组相比，睡眠剥夺组小鼠从投放水域自行寻找起点平台的时间有明显的增加（P≤0.05）（表2）。表明，小鼠经睡眠剥夺处理后，其记忆力显著减退。

表1 水迷路训练对小鼠记忆力的影响Table 1 Effects of water maze training on the faculty of mice memory

表2 睡眠剥夺对小鼠记忆力的影响Table 2 Effects of sleep deprivation on the faculty of mice memory

2.2 蓝莓提取物灌胃对小鼠体重的影响

为了确定蓝莓提取物是否影响小鼠胃肠道的消化与吸收功能，给予小鼠蓝莓提取物灌胃处理，共灌胃21 d。每天一次，灌胃浓度为5 mg·kg-1体重。每天记录小鼠的精神状态和粪便状态，并定时称量小鼠体重。结果显示，与对照组小鼠相比，蓝莓提取物灌胃后小鼠精神状态没有改变、无腹泻发生且体重没有明显变化（P＞0.05）（表3）。表明，蓝莓提取物灌胃的量与方式对小鼠精神状态、胃肠道消化与吸收及体重没有影响。

表3 蓝莓提取物对小鼠体重的影响Table 3 Effects of blueberry extracts on the body weight of mice

2.3 蓝莓提取物对小鼠睡眠剥夺型记忆力减退的影响

为了确定蓝莓提取物灌胃对青年小鼠睡眠剥夺型记忆力减退的影响，给予对照组和睡眠剥夺组小鼠蒸馏水灌胃，蓝莓提取物灌胃组小鼠以剂量为5 mg·kg-1体重的蓝莓提取物进行灌胃，同时使用泰盟TM-vision 水迷路装置对小鼠进行平台搜索训练（5 次·d-1），共计21 d。从平台搜训练的第15 天开始，对睡眠剥夺组和蓝莓提取物灌胃组小鼠进行18 h（18：00 到次日12：00）的睡眠剥夺，共进行7 d。睡眠剥夺后，也就是第22 天和第23 天，用泰盟TM-vision 水迷路装置检测小鼠的平台搜索时间变化情况。结果显示，与对照组和睡眠剥夺组小鼠相比，蓝莓提取物灌胃组小鼠的平台搜索时间没有发生显著变化（P＞0.05）（表4）。表明，蓝莓提取物对改善青年小鼠睡眠剥夺型记忆力减退没有明显效果。

表4 蓝莓提取物对睡眠剥夺导致的小睡记忆力减退的影响Table 4 Effects of blueberry extracts on sleep deprivation induced hypomnesia of mice

3 讨论

睡眠是人类和多种哺乳动物生活中重要的组成部分，高质量的睡眠是保证身体健康的必要条件。由于疾病或职业需求导致的失眠严重影响工作效率及身心健康，而且疲劳也是引发意外事故的主要原因。由于睡眠障碍引发的认知功能和记忆力下降被WHO 认定为重大公共安全卫生问题。睡眠剥夺一般是由环境或个体自身因素引起，导致个体难以进入睡眠状态的一种情况，随着人们生活节奏的不断加快，工作、学习压力越来越大，人们普遍受到由睡眠不足导致的睡眠剥夺状态的威胁[15-17]。这种情况在青少年群体发生率更高长时间处于睡眠剥夺状态的青少年，会产生一系列不良表现，如学习效率降低、学习效果变差、精神面貌涣散、免疫力低经常感冒、炎症频发等身体问题。有研究表明，人和动物的学习记忆能力受损程度与睡眠剥夺的持续时间成正比[18-19]。然而，市场上尚无显著改善睡眠剥夺导致记忆力减退的产品。

人类和动物的睡眠剥夺试验被广泛用于研究睡眠功能等相关问题，睡眠剥夺对大脑活动的宏观影响包括皮层对外界刺激的响应降低，主要表现为注意力不集中。睡眠剥夺对大脑的微观影响主要是腺苷水平的降低。然而，在不同观察尺度下，睡眠剥夺影响神经系统功能的机理尚不明确。但是，研究发现，小鼠经过7 d，每天18 h 的睡眠剥夺后，其在进行泰盟TM-vision 水迷路试验过程中，搜索平台的时间显著高于对照组小鼠。表明睡眠剥夺能够导致小鼠出现记忆力减退的现象。将在后续研究中检测睡眠剥夺组小鼠海马区中BDNF、p-ERK 及PDEs 指标变化情况及海马区的形态变化，为明确睡眠剥夺导致的小鼠记忆力减退的分子机制奠定基础。

蓝莓果实中富含花青素、单宁、黄酮、多酚、多糖等多种生物活性物质，具有极高的营养和药用价值，被联合国粮农组织（FAO）确定为人类五大健康食品之一[20]。已有研究证明，蓝莓提取物具有良好的清除氧自由基、抗氧化、预防癌症、延缓衰老、缓解视疲劳和提高免疫力等功能。蓝莓提取物在生物医学领域也拥有广泛的生物作用，对心脑血管疾病、炎症以及阿尔兹海默病等都有一定的积极作用。在研究中，以剂量为5 mg·kg-1体重的蓝莓提取物对小鼠进行灌胃，连续灌胃21 d。未发现小鼠出现精神萎靡、腹泻、呕吐或体重下降的情况，表明蓝莓提取物灌胃的量与给药方式对于小鼠不会造成伤害，以上剂量和给药方式是安全的。Miller[21]在Morris 水迷宫实验中发现，给19 月龄F344 老龄大鼠饲料中添加蓝莓、菠菜和草莓的提取物，可逆转其认知功能缺陷。Krikorian等[22]的研究表明，饮食中补充蓝莓可提高老年人的记忆力。Whyte 等[23-24]采用随机双盲试验证明低剂量的蓝莓提取物（ThinkBlueTM） 可提高老年人记忆力。McNamara 等[25]的研究表明鱼油与蓝莓联用对于改善老人主观认知障碍具有改善作用。然而，在研究中，采用的蓝莓提取物并未对小鼠睡眠剥夺型记忆力减退产生显著等改善作用。分析有如下原因：（1）泰盟TM-vision 水迷路试验中的水温过低，可能导致小鼠处于冷应激状态，使得小鼠搜索平台过程中产生了额外刺激因素，影响其平台搜索时间；（2）研究中选择的蓝莓提取物中有效成分少，灌胃量不足；（3）蓝莓提取物摄入周期较短。因此，将在接下来的研究中选择多种蓝莓提取物，且延长灌胃时间，比较不同蓝莓提取物对青年小鼠睡眠剥夺型记忆力减退的改善作用。通过检测小鼠海马区SOD、GSH-Px 和p-ERK水平探索蓝莓提取物改善青年小鼠睡眠剥夺型记忆力减退的分子机理。