萝卜硫素通过Nrf2/ARE信号通路对脂多糖性急性肺损伤机制的保护作用

刘振峰， 刘代顺， 刘建英， 周国旗， 李云飞， 曾静新

(1.遵义医科大学第三附院医院/贵州省遵义市第一人民医院呼吸内科， 贵州 遵义 563000 2.贵州省遵义市红花岗区人民医院呼吸内科， 贵州 遵义 563000)

ALI/ARDS的发生主要由直接和间接致伤因素导致毛细血管内皮损伤和肺泡上皮细胞损伤引发肺泡水肿和弥漫性肺间质，从而可造成急性低氧性呼吸功能不全[1]。ALI在临床中病理生理特征主要以通气/血流比例失调和肺容积减少等，严重者可发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。研究发现严重感染和大面积烧伤患者的死亡与ALI存在明显相关性，因此对ALI有效防治存在重要意义[2]。针对ALI临床多采用小潮气量进行保护机械通气，以此降低死亡率。目前ALI发病机制尚未有明确报道，因此探寻新的治疗方法已被诸多学者所关注。研究发现氧化应激在ALI和损伤机制中存在重要作用，且ALI发病机制中各细胞经呼吸爆发大量产生活性氧从而造成氧化应激的发生。正常生理情况下活性氧主要通过细胞内抗氧化反应元件(ARE)进行调控相关抗氧化酶的降解和去除[3]。合成内生性抗氧化酶中Nrf2是主要调节器，当Nrf2激活入核后直接参与了ARE的基因调控[4]。本文选取32只小鼠进行实验，观察内毒素诱发ALI后，SF是否可激活Nrf2表达上调，从而起到保护ALI的作用，以期为临床防治ALI提供新靶点。

1 材料与方法

1.1实验动物:选取32只6～8周龄雄性小鼠均有广东医学实验室提供(C57BL/6)，体重9～13g，饲养温度21±2℃；随机将32只小鼠分为SF组、对照组、SF溶剂组和ALI组，每组各8只。

1.2材料:SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒、Western blotting检测、全蛋白试剂盒、血气分析仪(GE premier3000)、IX51光学显微镜、凝胶成像分析系统、LPS、鼠抗人Nrf2单抗、萝卜硫素、SOD、MPO、iNOS、IL-6和TNF-α试剂盒。

1.3模型制作:SF溶剂组和SF组均行腹腔注射20mg/kg(SF)，2次/d，每次间隔8h，连续注射3d；第4d时ALI组、SF组和SF溶剂组注射腹腔脂多糖(LPS)10mg/kg，并制备内毒素诱发急性损伤模型；对照组腹腔注射10mg/kg生理盐水；注射生理盐水或LPS后6h，进行配制10%水合氯醛进行注射麻醉，再取腹主动脉血使用GE premier3000进行血气分析，并同时计算氧合指数(PaO2/FiO2)，急性肺损伤模型是否制备成功以氧合指数≤300mmHg(1mmHg=0.133kPa)为标准；下腔取血行肝素抗凝后立即自胸腔取出心肺组织。

1.4肺组织匀浆和干重/湿重比(W/D):依据上述方法处理后，将32只雄性小鼠进行处死，并立即自胸腔取出心肺组织；将左肺组织取出放入预冷生理盐水玻璃匀浆器中充分匀浆；MPO检测：制备10%组织匀浆，取0.45mL10%组织匀浆进行检测；剩余组织匀浆采用低温离心机进行离心(10000r/min)，离心10min，离心半径6cm，采集上清液并放于-80℃中保存，备至各项检测所用。将右肺尖叶肺组织取出进行称重，放于烘箱中，温度设定80℃，烘24h后面达到恒重量进行测定肺组织W/D比值。

1.5观察肺组织病理:使用盐水将右肺副叶肺组织进行浸洗后，采用福尔马林(10%)进行固定，并经梯度乙醇脱水置换，二甲苯透明后进行石蜡包埋，切片和染色后于IX51光学显微镜下观察肺组织病理学结果，并对肺组织损伤结果进行评分；随机选取每张切片10个视野进行观察评分[5]，取平均值。

1.6检测Nrf2核蛋白表达、IL-6和TNF-α水平含量:Nrf2应用Western blotting检测；使用Bradfo测定蛋白试剂盒提取的组织样品蛋白；每孔加入20μg蛋白进行凝胶电泳、转模和封闭后加入Nrf2一抗(1∶1000稀释)并于4℃下过夜孵育，次日采用TBST漂洗3次后加入二抗(1∶10000稀释)孵育后给予显色，并应用凝胶成像系统和Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析。IL-6和TNF-α水平含量采用ELIAS检测。

1.7SOD、MPO和iNOS使用比色法检测:严格根据试剂盒说明测定超氧化物歧化酶(SOD)、氧化物酶(MPO)和一氧化碳合酶(iNOS)的水平含量。

2 结 果

2.1观察各组小鼠肺组织病理学和W/D比值:通过光镜下可发现SF组、ALI组和SF溶剂组经切片HE染色明显可见炎症反应；对照组未见相关炎症反应的发生(图1)。SF组、SF溶剂组和ALI组肺损伤评分明显高于对照组，且W/D比值均高于对照组(P<0.05)；ALI组肺损伤评分和W/D比值高于SF组(P<0.05)；AIL组与SF溶剂组比较上述两项指标差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 比较4组小鼠肺组织病理学评分和W/D比值

图1 肺组织病理切片(HE×200)

2.2观察SOD、MPO和iNOS水平:SF溶剂组和ALI组MPO和iNOS水平明显较对照组升高，但SOD明显低于对照组(P<0.05)；SF组SOD水平明显较ALI组升高，但MPO和iNOS水平低于ALI组，差异具有统计学意义(P<0.05)；SF溶剂组与ALI组比较上述各项指标水平含量差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 比较4组肺组织SOD MPO和iNOS水平

2.3观察各组血清IL-6和TNF-α水平含量:SF溶剂组和ALI组IL-6和TNF-α水平含量明显较对照组升高(P<0.05)；SF组IL-6和TNF-α水平含量低于ALI组，差异具有统计学意义(P<0.05)；ALI组IL-6和TNF-α水平含量与SF溶剂组比较差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

表3 比较4组血清IL-6和TNF-α水平含量

图2 比较4组小鼠肺组织Nrf2核蛋白表达

2.4观察各组肺组织Nrf2核蛋白表达情况:SF溶剂组与ALI组Nrf2核蛋白表达明显较对照组上调(P<0.05)；SF组肺组织Nrf2核蛋白表达明显较ALI组上调(P<0.05)；ALI组与SF溶剂组比较Nrf2核蛋白上调表达情况差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

3 讨 论

目前引发ALI的诱因较多，其中常见的内毒素是致其发病的主要原因。研究显示SF溶剂组和ALI组LPS注射6h后肺组织W/D比值明显降低，而肺损伤组织评分明显升高，说明模型建立成功。研究表明ALI组肺组织Nrf2核蛋白表达明显较对照组上调，考虑Nrf2核蛋白表达的原因与LPS激活机体氧化应激有关，从而引起内源性免疫系统反应升高Nrf2进行对抗损伤，但此保护作用不足以对抗炎症介质造成的损伤，因此最终结果显示肺损伤程度加重。研究发现SF组肺组织Nrf2表达、W/D比值和抗氧化酶明显较ALI组升高，且肺损伤评分和各项抗氧化应激损伤指标低于ALI组(P<0.05)，说明SF可通过激活Nrf2表达减轻LPS诱导ALI的加重，造成氧化应激损伤指标和促炎介质降低，抗氧化酶升高等，有效起到了保护机体和调节作用。ROS造成的氧化应激反应在ALI发病机制中存在重要作用[6]。生理情况下ROS主要通过细胞内ARE调控相关解毒和抗氧化酶的降解/去除。正常生理状态下Nrf2定位于细胞浆，与Keaol结合成复合物[7]。当机体发生氧化应激情况下，Nrf2磷酸化并自Keaol蛋白上解离后进入细胞核并于ARE结合，启动其下游多个抗氧化基因和解毒酶进行转录翻译，并以此进行对抗氧化应激反应[8]。研究发现[9,10]Nrf2/ARE信号通路在急性肺损伤中起到了重要保护作用，若将其阻断可加快小鼠脓毒症器官的损伤。Nrf2表达可通过SF进行上调表达，是Nrf2基因的重要激活剂[11]。本研究发现SF组Nrf2表达明显较ALI组增加，且ALI组抗氧化酶、肺损伤组织评分和各项应激损伤指标明显低于SF组，证实SF可通过诱导Nrf2提高表达起到保护ALI的作用。本研究为SF对ALI的预防干预性研究，简单探讨了Nrf2/ARE通路在ALI中起到的作用。笔者将进一步研究SF联合或对比其他抗氧化剂对ALI保护作用，且Nrf2/ARE通路具体的作用机制及是否有其他通路与之共同作用干预ALI的发生和发展也有待进一步探讨。

综上所述，SF可通过激活Nrf2/ARE对内毒素造成的ALI损伤可起到明显保护作用。