免疫组织化学法双色银染原位杂交与荧光原位杂交技术检测乳腺癌HER-2基因状态的应用

刘继英， 陈明光， 韩明其， 龚云辉， 黎 辉

(福建省南平市第一医院病理科， 福建 南平 353000)

HER-2是定位于人17号染色体(chromosome 17 centromere locus，CEP17)长臂上的原癌基因，HER-2基因状态与肿瘤发生、进展密切相关，且HER-2也可作为乳腺癌预后的评估指标[1,2]。因此，如何提高病理学检查HER-2基因状态的准确性，是当前学者们研究的热点之一。免疫组织化学法(immuno-histochemistry，IHC)是检查HER-2最常用手段之一，而随着检查技术的更新，目前双色银染原位杂交(dual-color silver-enhanced in-situ hybridization，DISH)、荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)等技术也被用以检查HER-2基因状态，但各种检查方式各有优缺点，且目前综合评价3种检查方式对于HER-2基因状态效果的研究并不多[3]。为提高临床检查HER-2基因状态的准确性，现选取乳腺癌组织标本作为研究对象，观察IHC、DISH、FISH对于HER-2基因检查的效果。研究结果如下。

1 资料与方法

1.1材 料

1.1.1研究对象:回顾性的选取2017年1月至2019年12月我院收治的180例乳腺癌患者作为研究对象，均为女性，年龄28～65岁，平均年龄(45.29±6.18)岁，其中导管癌132例、导管内癌48例，均为单侧。所有患者留取组织标本前，均未接受放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗等治疗，且手术切组织0.5h内经甲醛固定。

1.1.2试剂与材料:乙二胺四乙酸二钠抗原修复液(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA)、柠檬酸钠缓冲液(sodium citrate-hydrochloric acid buffer solution，SSC)、甲酰胺、二脒基苯基吲哚荧光染料(4,6-siamidino-2-phenylindole,dihydrochloride，DAPI)、二氨基联苯胺(3,3-diaminobenzidine，DAB)显色液均购自北京凯瑞基生物科技有限公司，磷酸缓冲盐溶液、3%过氧化氢液(A液，自配)、二甲苯均购自上海钰博生物科技有限公司，非免疫性动物血清封闭液(B液)购自南京森贝伽生物科技有限公司，HER-2抗体免疫组化试剂盒(即用型鼠抗人单克隆抗体)购自北京中杉金桥生物公司，苏木精由Solarbio提供，罗氏全自动免疫组化仪购自于Roche Benchmark XT，DISH检测试剂由Ventana提供，PAthena Vysion HER-2 DNA探针试剂盒购自美国雅培公司，BX41光学显微镜、BX51荧光显微镜均购自奥林巴斯科学仪器(中国)有限公司。

1.2方 法

1.2.1IHC:取组织标本，常规脱蜡、洗片，PBS冲洗，加EDTA修复组织抗原，PBS缓冲液冲洗，加A液，PBS冲洗，加B液，PBS缓冲液冲洗，加一抗(37℃、40min)、PBS冲洗、加DAB显色液，上镜观察3～10min，镜内出现棕黄色，取下流动自来水冲洗，并苏木精复染、冲洗返蓝、脱水、二甲苯，封固，镜检；并以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照组，以试剂盒内提供的WTX阳性肾组织为阳性对照组。

1.2.2DISH:取组织切片，65℃恒温箱烤片1～2h，上罗氏BenchMark CX全自动免疫组化染色机，加DISH检测试剂，反应结束后取片，蒸馏水冲洗，梯度酒精脱水，加二甲苯浸泡至透明，封固；并以肿瘤周边内皮细胞、淋巴细胞等非肿瘤细胞作为内对照。

1.2.3FISH:取组织切片，65℃恒温箱烤片过夜、加二甲苯脱蜡(10min/次、2次)，复水，加30%酸性亚硫酸钠(50℃、20～30min)处理、SSC漂洗(5min/次、2次)、酶消化、脱水，浸入丙酮(2min)、干燥，加盖玻片(56℃、3min)后浸入变性溶液(73℃、5min，以下操作均为避光操作)，取出切片至梯度酒精脱水(-20℃)、预热(45～50℃、2～5min)后于探针与42℃环境中过夜杂交，取玻片甲酰胺洗涤，自然干燥后加DAPI复染，静置20～30min后上荧光显微镜观察。

1.2.4判读:均由2名病理科医师判读，以最终一致结果为最终结果。IHC参照ASCO/CAP HER-2 HER-2检测指南(2013版)[4]，(-)、(+)为阴性，(++)可疑阳性、(+++)阳性，(-)无着色或<10%癌细胞膜微弱着色或弱且不完整着色，(+)≥10%癌细胞弱着色，(+++)>10%癌细胞强且完整着色，余为(++)。DISH参照ASCO/CAP HER-2指南(2013版)，HER-2基因呈黑色信号、CEP17呈红色信号，观察信号清晰的癌细胞，连续计量20个细胞信号，计算HER-2/CEP17(比值a)、平均HER-2拷贝数/细胞数(比值b)，若比值a<2.0、且比值b<4.0为无扩增；若比值a<2.0、4.0≤比值b<6为不确定，再计数20个细胞信号；比值a≥2.0、比值b>6.0视为有扩增，且CEP17拷贝数/细胞数≥3为CEP17多倍体。FISH参照参照指南[4]，HER-2基因呈红色信号、CEP17呈绿色信号，观察信号清晰的癌细胞，计量30个细胞信号，若比值a<1.8为阴性、比值a>2.2为阳性，1.8≤比值a≤2.2为不确定，则需计数40个复测，且CEP17平均数为1.76～2.25为二倍体、CEP17≥3.0为多倍体。

1.3统计学处理:采用统计软件SPSS22.0处理数据，行一致性检验，Kappa值表示，且Kappa值取0～1，Kappa≥0.75一致性较好、0.75>Kappa≥0.40一致性一般，Kappa<0.40一致性差，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1一般资料:180例患者中，淋巴转移15%(27/180)，IHC检查HER-2表达阴性118例(其中(-)83例、(+)35例)、表达阳性49例，另有13例标本为可疑阳性。

2.2DISH与IHC比较:DISH检查HER-2扩增56例、无扩增107例、不确定17例；多倍体17例，占比9.44%，其中IHC阳性检出58.82%(10/17)、IHC可疑阳性检出0(0/17)、IHC阴性检出41.18%(7/17)；且，HER-2/CEP17比值范围为0.6～17.6，中位数为2.1。DISH与IHC比较，DISH无扩增与IHC阴性表达符合率为83.05%[(69+29)/(83+35)]、DISH扩增与IHC阳性表达符合率为83.67%(41/49)，去除DISH不确定、IHC可疑阳性，2种检测方式的Kappa值为0.788(P=0.000)，一致性较好。详见表1。

表1 DISH与IHC比较n(%)

表2 FISH与IHC比较n(%)

2.3FISH与IHC比较:FISH检查HER-2扩增54例、无扩增107例、不确定19例；多倍体16例，占比8.89%，其中IHC阳性检出62.5%(10/16)、IHC可疑阳性检出0(0/16)、IHC阴性检出37.5%(6/16)；且HER-2/CEP17比值范围为0.8～10.1，中位数为1.8。FISH与IHC比较，FISH无扩增与IHC阴性表达符合率为82.20%[(72+25)/(83+35)]、FISH扩增与IHC阳性表达符合率为81.63%(40/49)，去除FISH不确定、IHC可疑阳性，2种检测方式的Kappa值为0.784(P=0.000)，一致性较好。详见表2。

2.4DISH与FISH比较:DISH与FISH比较，2种检查方式在HER-2无扩增中的符合率为99.07%(106/107)，而在HER-2扩增中的符合率为98.15%(53/54)，且2种检测方式的Kappa值为0.939(P=0.000)，一致性高；去除DISH不确定、FISH不确定，2种检查方式的Kappa值为1.000(P=0.000)。详见表3。

表3 DISH与FISH比较n(%)

3 讨 论

随基因学、蛋白质组学等学科在临床实践中的发展，越来越多的学者、专家意识到分子病理学在肿瘤的早期诊断、靶向治疗、预后评价中的重要地位，也使得传统经验诊治模式向着个体化治疗转变。要进行有效的个体化治疗，继续对乳腺癌进行科学的分型，且乳腺癌分型越准确其指定的干预手段能使患者获益更多[5]。乳腺癌从最初的形态学病理分型发展，至今已演变为以管状A/B型、基底样癌、HER-2过表达等分型，其中20%～30%的乳腺癌患者存在HER-2过表达[6]，而HER-2过表达的患者与HER-2无扩增、低扩增患者相比，过表达患者预后差、生存时间短。尽管HER-2过表达对传统CME、他莫昔芬等治疗不敏感，但对HER-2过表达患者应用曲妥珠单抗、拉帕替尼、帕妥珠单抗等药物[7,8]，可有效提高患者无病生存期、改善预后。不过，针对HER-2的靶向药物又会增加治疗费用和毒副作用，因此，对HER-2过表达的乳腺癌患者行个体化治疗时，既要考虑提高临床效果，又要避免不必要的治疗，而这就有赖于能否准确评价乳腺癌患者HER-2基因状态。

IHC、DISH、FISH均可对HER-2是否过表达进行评价。其中IHC的特异性抗体具有显色作用，能够对抗原状态行定位、定量、定性分析，IHC法可通过检测HER-2蛋白从而评价HER-2基因状态。在本组案例中结果显示，IHC检测HER-2蛋白阳性表达率为27.22%，这提示IHC具有一定的评价能力。IHC相比于其他检查手段，其操作简单、敏感性高等优势，在基层医院及大量样本中评判HER-2中具有良好的应用价值。但IHC也有其不足，首先IHC是对HER-2蛋白的评估，并不是直接对HER-2基因状态加以分析的，且在检查过程中的标本制作、染色处理、结果判读等受操作者影响较大，可能导致标本中HER-2蛋白被破坏，其特异性较低，因而需探讨更为合适的检测手段。DISH于2013年被ASCO/CAP HER-2指南推荐为检查HER-2基因状态的检测手段之一，DISH是通过银沉淀技术对HER-2、CEP17拷贝数显现不同颜色信号加以分析HER-2基因状态，且DISH具有切片保存时间久、无需避光观察、全自动分析仪操作等优势。本组案例中结果显示，DISH检查HER-2扩增56例、无扩增107例、不确定17例，且与IHC的一致性较高，Kappa值为0.788。但DISH也有其不足，DISH检查不是各个院级都可进行的，而各种因素导致评判信号的不准确影响最终结果；另外，DISH作为评估乳腺癌患者HER-2基因状态的新手段，要在临床广泛应用的基础也是基于DISH与FISH具有高一致性。FISH是检测基因的“金标准”，重复性好、受标本处理影响小，在荧光显微镜下就可观察到荧光信号，从而对HER-2基因扩增情况加以分析[9]。虽然FISH被视为评价基因的金标准，但FISH也有其不足，首先是FISH操作繁琐复杂、耗时长，各操作都需在避光条件下进行，且荧光易淬灭、染色切片并不适宜长期保存，最后其成本也高，因此FISH并不适宜在HER-2基因状态检查中应用和推广。本组案例结果显示，FISH与IHC的一致性较好，Kappa值为0.784，这提示IHC在评估HER-2基因状态中具有一定的可靠性；而与DISH比较，2种检查方式的Kappa值为0.939(去除不确定案例，2种检查手段的符合率高达100%)，这提示，DISH具有临床评估乳腺癌HER-2基因状态广泛应用的前提。结合分析3种检查手段的优缺点：临床要对乳腺癌患者HER-2基因状态进行评价，其乳腺癌组织标本可先行IHC检测，若IHC报告为阴性、阳性可直接给予报告，并根据HER-2是否过表达考虑是否进行靶向治疗，对于IHC诊断为可疑阳性的标本可选择DISH行下一步评价，但为提高检测HER-2基因的准确性也可适当选择FISH，但无论是何种检查方式，操作者都应严谨操作、规范流程。

总而言之，IHC、DISH、FISH均可对乳腺癌患者的HER-2基因状态行评估，可以IHC作为筛查手段，若医疗资源许可应当结合DISH检查结果制定治疗方案。