肿瘤标志物TTF-1预测肺腺癌EGFR突变模型的构建及初步评估

杨燕君， 张晓丽， 董跃华， 姜伟华， 王贵刚， 魏玉磊， 周 义， 高永山

(河北北方学院附属第一医院胸心外科， 河北 张家口 075000)

近年来，肺癌发病率、死亡率均明显升高，是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，主要包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌两种类型。肺腺癌属于非小细胞肺癌，早期症状一般不明显，多数患者发现时已经晚期，临床病死率较高。目前，酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)等靶向药物已成为晚期肺腺癌患者治疗的重要方式之一，尤其是针对有表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因突变的患者[1]。研究发现EGFR基因突变的肺腺癌患者接受EGFR-TKIs靶向治疗后，可明显降低死亡风险，改善患者生存质量[2]。但由于EGFR基因检测对组织标本、实验设备等要求较高，且检测费用昂贵，接受EGFR基因突变检测患者较少，导致基于肿瘤驱动基因突变的靶向治疗难以实施。因此，寻找能够有效、准确预测肺腺癌患者EGFR基因突变的肿瘤标志物，对指导患者靶向治疗具有重要临床意义。甲状腺转录因子-1(thyroid transcription factor-1，TTF-1)常表达于肺和甲状腺组织中，其异常表达传统用于肺腺癌病理分型[3]，而与患者EGFR基因突变关系研究相对较少。鉴于此，本研究通过分析不同EGFR基因表型肺腺癌组织TTF-1表达差异，并探讨肺腺癌组织TTF-1表达联合其他因素对患者EGFR基因突变的预测价值。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2018年6月至2019年5月本院胸心外科收治的120例初治肺腺癌患者作为受试对象。纳入标准：①均经组织病理学检查确诊为肺腺癌；②组织标本来源于经皮穿刺或经纤维支气管镜肺活检；③均接受EGFR基因表型检测；④临床资料详细完整。排除标准：①原发灶位于肺外；②入组前未接受任何抗肿瘤治疗；③治疗期间患者依从性差；④伴有严重心、肝、肾等疾病者；⑤女性哺乳期。根据EGFR基因表型检测结果将120例患者分为EGFR基因野生(非突变)组72例、EGFR基因突变组48例。EGFR基因野生组有男性39例、女性33例，年龄25～65岁、平均年龄(47.39±9.27)岁，有吸烟史(连续或累计吸烟≥6个月)35例、无吸烟史37例，功能状态(performance status，PS)评分≤2分36例、>2分36例，肿瘤位置：左肺32例、右肺40例，TNM分期：Ⅲ期45例、Ⅳ期27例；EGFR基因突变组有男性12例、女性36例，年龄25～64岁、平均年龄(47.20±10.05)岁，有吸烟史(连续或累计吸烟≥6个月)10例、无吸烟史38例，PS评分≤2分31例、>2分17例，肿瘤位置：左肺18例、右肺30例，TNM分期：Ⅲ期19例、Ⅳ期29例。本研究方案符合本院伦理委员会要求，且患者均自愿签署知情同意书。

1.2TTF-1表达检测:所有组织标本均用10%甲醛溶液固定，脱水后石蜡包埋，连续切片(厚4μm)，使用小鼠抗人TTF-1单克隆抗体试剂(购自上海冠导生物工程有限公司)，以En Vision免疫组化法检测TTF-1表达，操作步骤参照试剂盒说明书。结果判定：TTF-1染色定位于细胞核，阴性(-)：无阳性细胞染色，弱阳性(+)：阳性细胞染色≤10%，中阳性(++)：10%<阳性细胞染色≤50%，强阳性(+++)：阳性细胞染色>50%。

1.3EGFR基因表型检测:使用扩增阻滞突变系统法进行聚合酶链反应(RT-PCR)扩增，主要检测EGFR基因外显子18、19、20、21突变。人EGFR基因突变检测试剂盒购自北京雅康博生物科技有限公司，具体步骤按照试剂盒说明书进行。结果判定：样品外控信号扩增曲线Ct值≥26提示为野生型，<26则提示为突变型。

2 结 果

2.1不同EGFR基因表型肺腺癌患者TTF-1表达阳性率比较:TTF-1定位于细胞核，以细胞核出现棕黄色或褐色颗粒为阳性表达(图1)。检测结果显示，EGFR基因突变组肺腺癌患者TTF-1表达阳性率显著高于EGFR基因野生组患者(P<0.05)，见表1。

表1 不同EGFR基因表型肺腺癌患者TTF-1表达阳性率比较n(%)

图1 免疫组化染色细胞核中TTF-1表达(En Vision免疫组化法×200)

2.2EGFR基因突变情况与肺腺癌患者临床病理参数的关系:EGFR基因突变情况与肺腺癌患者年龄、PS评分及肿瘤位置均无关(P>0.05)，与肺腺癌患者性别、吸烟史及TNM分期均有关(P<0.05)，见表2。

2.3影响肺腺癌患者EGFR基因突变的多因素Logistic回归分析:以肺腺癌患者是否发生EGFR基因突变为因变量，以性别、吸烟史、TNM分期、TTF-1表达为自变量进行多因素Logistic回归分析。结果发现TNM分期、TTF-1表达是肺腺癌患者发生EGFR基因突变的独立危险因素(P<0.05)，而性别、吸烟史与肺腺癌患者EGFR基因突变发生无独立相关性(P>0.05)，见表3。

表2 EGFR基因突变情况与肺腺癌患者临床病理参数的关系n(%)

表3 影响肺腺癌患者EGFR基因突变的多因素Logistic回归分析

表4 TTF-1表达单独及其与临床病理参数联合对肺腺癌患者EGFR基因突变检查结果

2.4TTF-1表达单独及其与临床病理参数联合对肺腺癌患者EGFR基因突变的预测价值:以TTF-1、性别、吸烟、TNM分期作为变量构建肺腺癌患者EGFR突变分析的预测模型，发现TTF-1、性别、吸烟、TNM分期四者联合预测肺腺癌患者发生EGFR基因突变的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值及阴性预测值均最高，其次为TTF-1、性别、吸烟三者联合预测，再次为TTF-1联合性别预测，TTF-1表达单独预测灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值及阴性预测值均最低，见表4、表5。

表5 TTF-1表达单独及其与临床病理参数联合对肺腺癌患者EGFR基因突变的预测价值(%)

3 讨 论

肺腺癌是腺上皮恶性肿瘤，大约占肺原发肿瘤的40%，早期无特殊症状，发展至晚期时病情较严重，需及时对症治疗。随着分子生物学的迅速发展，以肿瘤驱动基因为靶点的靶向治疗可明显延长患者生存期，已成为当前晚期肺腺癌个体化治疗的新方向[4]。研究发现伴有EGFR基因突变的肺腺癌患者才能从EGFR-TKIs靶向治疗获益，因此接受EGFR-TKIs靶向治疗前必须检测患者EGFR基因突变情况[5]。目前，临床检测EGFR基因方法多样，但检测技术要求均较高，且因费时、费用高而难以普及开展。因此，寻找可靠有效的肿瘤标志物用于预测肺腺癌患者EGFR基因突变情况至关重要，以期为临床使用EGFR-TKIs靶向治疗肺腺癌提供帮助。

TTF-1又称为NKX同源框-1(NKX2-1)，属于NKX2转录基因家族，位于人染色体14q13.3，生理状态下主要分布于甲状腺和部分大脑前腹侧核，其异常表达影响甲状腺和肺功能，在肿瘤形成、发展过程中起重要作用[6,7]。作为一种常见的肿瘤标志物，TTF-1在肺腺癌诊断、治疗及预后评估方面均具有非常明显的应用价值[8]。赵焕芬等[9]研究表明，癌组织TTF-1表达可用于肺腺癌与肺鳞癌的鉴别诊断，且与其他指标联合有助于提高肺腺癌诊断的灵敏度和特异性。彭昆伟等[10]研究发现，肺腺癌组织TTF-1阳性患者中EGFR基因突变率显著高于阴性患者，临床可根据TTF-1表达情况筛选EGFR基因突变高危患者。此外，丁重阳等[11]研究报道，EGFR基因突变在女性、不吸烟及TTF-1表达阳性肺腺癌患者中较高，且多因素Logistic回归分析显示TTF-1阳性是EGFR基因突变的独立影响因子。综上发现，本研究探讨肿瘤标志物TTF-1预测肺腺癌EGFR突变模型的构建及初步评估具有一定临床意义。

本研究结果发现，EGFR基因突变组肺腺癌患者TTF-1表达阳性率远高于EGFR基因野生组患者，与彭昆伟等[10]研究结果基本一致，提示肺腺癌组织TTF-1表达阳性患者可能更易发生EGFR基因突变；且研究发现EGFR基因突变状态还与肺腺癌患者性别、吸烟史及TNM分期有关，提示临床使用TTF-1表达预测肺腺癌患者EGFR基因突变状态时，可同时将患者性别、吸烟史及TNM分期结合起来考虑，可能更有助于预测肺腺癌EGFR基因突变情况。多因素Logistic回归分析结果发现，TNM分期、TTF-1表达是肺腺癌患者发生EGFR基因突变的独立危险因素，与丁重阳等[11]研究结果类似，进一步提示分析肺腺癌患者TNM分期和TTF-1表达可能对预测EGFR基因突变状态具有重大作用。本研究将TTF-1、性别、吸烟、TNM分期作为变量构建肺腺癌患者EGFR突变分析的预测模型，发现预测灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值及阴性预测值高低依次为：TTF-1、性别、吸烟、TNM分期四者联合预测，TTF-1、性别、吸烟三者联合预测，TTF-1联合性别预测，TTF-1表达单独预测，提示多个因素构建的预测模型可提高对肺腺癌患者EGFR基因突变的预测能力。

综上所述，肺腺癌患者TTF-1阳性提示EGFR基因突变，TTF-1联合性别、吸烟、TNM分期对肺腺癌患者EGFR基因突变状态预测价值最高，检测TTF-1表达可为肺腺癌患者EGFR-TKIs靶向治疗提供一定参考。本研究预测肺腺癌EGFR突变模型的构建纳入变量较少，应扩大样本量继续进行研究。