蒙药蓝刺头对去卵巢大鼠BALP 、TRACP、股骨头形态影响 *

赵 军, 李 昕, 易媛媛, 王雄耀, 师建平, 董重阳, 常 虹, 高小明, 莫日根, 谢静华, 刘 岩

(1.内蒙古自治区中医医院; 2内蒙古医科大学中医学院; 3内蒙古医科大学附属医院)

骨质疏松属蒙医经典文献“骨枯症”范畴。“肾主骨生髓,髓养骨;肾虚骨枯髓减”等古医籍阐发,蒙医认为骨质疏松(osteoPorosis,OP)根本病因为肾虚。PMOP因女性绝经后卵巢功能衰退致,属高转换型OP。19世纪蒙医著作经典《观者之喜》“老年人赫依偏盛,易骨枯,治以补为主,补暖补精,而抑赫依过剩……”[1,2]。蒙药蓝刺头性凉,味苦,效轻、稀、柔、钝,接骨愈伤、固骨质[3]。本实验通过观察蒙药蓝刺头对去卵巢OP模鼠血清BALP、TRACP、左侧股骨头OC骨吸收陷窝数量调节,观察BMD变化。

1 材料

1.1 实验药品、试剂

蒙药蓝刺头制剂由广州中医药大学科技产业园提供。强骨胶囊:北京岐黄制药有限公司,规格:0.25g/粒,30粒/瓶,产品批号:188103,国药准字Z20030007。己烯雌酚片:合肥久联制药有限公司,规格:0.5mg/片,产品批号:20180925,国药准字H34021250。骨碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶 ELISA试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司提供);甲苯胺蓝染液;5%碱性美蓝溶液;PBS缓冲液。

1.2 实验动物

4月龄Wistar大鼠雌性84只,购于内蒙古大学实验动物中心,合格证号:SCXK(蒙)2002-0001。内蒙古医科大学基础实验楼病理实验室饲养,每笼12只,购回适应环境7d左右。

2 方法

2.1 分组、模型制备

对84只大鼠随机平均分7组(蓝刺头高剂量组、中、低剂量组、强骨胶囊组、己烯雌酚组、模型组、假手术组)。参考文献[4]行PMOP模型复制,假手术组不切卵巢只切卵巢周围少量脂肪,缝合创口后5d,将大鼠阴道脱落细胞涂片[5]确定造模成功(图1、图2),30d后任意选取2只行子宫HE观察(见图3、图4)。

2.2 药物干预、标本采集

90d后行药物干预灌胃给药。蒙药蓝刺头低、中、高剂量组据人鼠体重比、人鼠代谢速率比折算以6.8750mg/mL、13.7500mg/mL、27.5000mg/mL给药,临床等效剂量低剂量组为准,剂量比例高、中、低为4∶2∶1。己烯雌酚0.0313mg/mL,强骨胶囊23.4375mg/mL,均按有效成人量给药;生理盐水体积相应对假手术组、模型组灌胃。终每组按9只计。采血离心;剖取双侧股骨4%甲醛液固定。

2.3 显微CT右侧股骨BMD计量学指标分析(见表1)

2.4 按BALP、TRACP试剂盒说明书步骤行,用酶联仪测各孔吸光度(OD)值(见表2、表3)

2.5 甲苯胺蓝染色方法检测股骨头破骨细胞骨吸收陷窝计数

2.5.1大鼠股骨脱钙、蜡块制备[6]

2.5.2甲苯胺蓝染色 梯度酒精脱水甲苯胺蓝固体(Toluidine Blue O)1.0g+70%酒精(alcohol)100.0mL+1%氯化钠(Sodium chloride)900mL染色观察。每组大鼠取5张切片(n0),每张切片随机选5个视野(n1),光学显微镜观察各组染色情况,采用医学图像分析系统,光镜下骨OC骨吸收陷窝计数(n2)(见表4)。

3 统计方法

3 实验结果

3.1 骨形态计量变化

表1得出,显微CT扫描大鼠右侧股骨近心端,测BMD g/cm3示:(1)模型组与假手术组相比差异显著(P<0.01);蒙药蓝刺头中、低剂量组、假手术组、强骨胶囊组、己烯雌酚组与模型组比差别明显(P<0.01);蒙药蓝刺头高剂量组与模型组比相比差别不明显(P>0.05);蒙药蓝刺头低、中剂量组、己烯雌酚组、强骨胶囊组、假手术组与蒙药蓝刺头高剂量组比区别显著(P<0.05);蒙药蓝刺头中、低剂量组、强骨胶囊组、己烯雌酚组、假手术组之间比差别不明显(P>0.05)。

表1 形态计量结果比较

3.2 大鼠血清骨碱性磷酸酶变化

表2 各组大鼠血清BALP比较

表2得出,大鼠血清骨碱性磷酸酶(BALP)表达模型组较假手术组、蒙药蓝刺头中剂量组、己烯雌酚组、强骨胶囊组明显增高(P<0.01);蒙药蓝刺头高、低剂量组与模型组比差别不明显(P>0.05);蒙药蓝刺头高、低剂量组与强骨胶囊组、己烯雌酚组、蒙药蓝刺头中剂量组、假手术组比区别明显(P<0.05);强骨胶囊组、己烯雌酚组、蒙药蓝刺头中剂量组、假手术组比区别不明显(P>0.05)。

3.3 大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶变化

表3 各组大鼠血清TRACP比较

表3得出,大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)表达模型组较假手术组、蒙药蓝刺头中剂量组、己烯雌酚组、强骨胶囊组明显增高(P<0.01);蒙药蓝刺头高、低剂量组与模型组比差别不明显(P>0.05);蒙药蓝刺头高、低剂量组与强骨胶囊组、己烯雌酚组、蒙药蓝刺头中剂量组、假手术组比区别明显(P<0.05);强骨胶囊组、己烯雌酚组、蒙药蓝刺头中剂量组、假手术组比区别不明显(P>0.05)。

表4 各组大鼠左侧离体股骨头破骨细胞骨吸收陷窝数比较

表4得出,左侧股骨头甲苯胺蓝染色观察OC骨吸收陷窝数模型组与假手术组比差异显著(P<0.05);蒙药蓝刺头中、低剂量组、假手术组、强骨胶囊组、己烯雌酚组与模型组比差别明显(P<0.05);蒙药蓝刺头高剂量组与模型组相比比差别不明显(P>0.05);蒙药蓝刺头低、中剂量组、己烯雌酚组、强骨胶囊组、假手术组与蒙药蓝刺头高剂量组比区别显著(P<0.05);蒙药蓝刺头中、低剂量组、强骨胶囊组、己烯雌酚组、假手术组之间比差别不明显(P>0.05)。

4 讨论

OP骨微结构改变,全身骨量减少,骨脆性增加,骨折易发。OP包括原发、继发,原发最常见,多发绝经后中老年妇女,全身老年性改变在骨骼系统反映。碱性磷酸酶(ALP或AKP)普遍存在于细胞质膜的胞内酶。ALP不单一,来自骨细胞为ALP3[7]。血清ALP主要来源于骨骼细胞、肝脏,分别称肝特异性、骨特异性ALP。在成骨细胞(OB)表型标志物中,BALP极为重要。BALP由骨质中成熟阶段OB原位表达分泌到细胞外后与骨基质结合[8];骨矿化与BALP相关密切[9,10]。酸性磷酸酶存在于OC内溶酶体酶。TRACP是其同工酶,不依赖Ⅰ型胶原降解,主存于成熟OC、有活性巨噬细胞,OB中少含,反映出骨吸收[11]。OC发育、功能是影响骨吸收重要环节。能否在骨形成骨吸收陷窝评价OC是否真正功能“金标准”[12,13]。实验表明蒙药蓝刺头在适当剂量可抑制去卵巢大鼠血清BALP、TRACP表达、OC骨吸收陷窝形成,提高BMD,起一定抗骨破坏、保护骨作用。还需行大量实验研究验证。

综上,大鼠在去卵巢以后血清BALP、TRACP表达、OC骨吸收陷窝数均明显增高,BMD明显降低;蒙药蓝刺头具使血清BALP、TRACP表达、OC骨吸收陷窝数目明显降低,效果同己烯雌酚、强骨胶囊相似起有效抗骨破坏、保护骨作用,为蒙医“补暖补精-清镇赫依-固骨质壮骨”理论防治PMOP提供实验依据,其详细机制、作用通道还需进一步研究。