Notch1、Akt、PTEN及ABCG2在直肠癌干细胞中的表达研究 *

曲 泽, 姜 东, 侯明星

(1.内蒙古医科大学附属医院 老年医学中心Ⅱ区,内蒙古呼和浩特010059; 2.内蒙古医科大学第二附属医院)

本文从结肠癌细胞系HCT116中分离得到CD133+结肠癌干细胞,通过体外无血清培养基培养及CD133抗体标记后的流式细胞筛选,从人结肠癌细胞系HCT116中分离得到CD133+结肠癌干细胞,采用qRT-PCR检测手段NOTCH1、AKT、PTEN及ABCG2在结肠癌干细胞及普通结肠癌细胞中mRNA的表达水平进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料

结肠癌HCT116细胞株购于中国科学院上海生命科学院细胞库。

1.2 流式细胞仪分选结肠癌干细胞

细胞经过传代培养后,配制FACS分选缓冲液,取成球生长的干细胞,清洗消化制成1mL单细胞悬液如上,细胞计数,调整细胞个数,密度为107/mL。弃上清液,加入1mLLFACS分选缓冲液上机分选。对照组加入PBS。

1.3 RNA 的提取和qRT-PCR

取分选后培养成球的结肠癌干细胞。用胰酶-PBS混合液消化细胞球,加入5%FBS的1640培养液中制成单细胞悬液。细胞传代培养,将6孔板倒置并肉眼直接计数细胞克隆数,数三次,计算每组平均数,计算。细胞裂解后测定各细胞因子RNA的浓度及进行反转录。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 流式细胞仪分选的CD133+结肠癌干细胞

分别将人结肠癌HCT116细胞及HCT16干细胞球制成单细胞悬液,上机分析并进行流式细胞分选。经CD133抗体标记后,HCT116细胞球中CD133+结肠癌干细胞数为4.28%±1.21%。

2.2 结肠癌干细胞的体外克隆增殖情况

通过观察其集落形成能力,判断其增殖能力。结果表明分选出的CD133+结肠癌干细胞相比较普通结肠癌细胞具有更强的增殖分化能力(见图1)。

2.3 qRT-PCR各反应物表达情况

分别以结肠癌干细胞及普通结肠癌细胞为研究对象,应用实时定量PCR检测各基因在细胞周期内的相对表达量2-ΔΔCt,内参为管家基因β-actin,结果(见表1)。在结肠癌干细胞中,NOTCH1、AKT及ABCG2的mRNA表达高于普通结肠癌细胞,而抑癌基因PTEN mRNA表达量明显低于对照组。

3 讨论

Notch信号转导通路参与细胞正常增殖和分化、参与T细胞发育、调节血管生成、参与器官和组织的更新。在结直肠癌领域内,Notch1信号转导通路同样起着极为重要的作用。我们的实验,通过实时定量PCR实验检测,证实Notch1的mRNA在CD133+的结肠癌干细胞中的含量远远超过普通肿瘤细胞。CD133+的结直肠癌干细胞比未分型的干细胞,具有更强的致瘤性及无限增殖能力[1],这也从侧面论证了我们实验结果的正确性。

表1 结肠癌干细胞(CSCs)及HCT116细胞中各因子mRNA表达相对水平

AKT信号转导通路参与调控细胞周期、启动凋亡系统、参与血管淋巴管生成及细胞迁移等过程。活化的AKT能够通过促进肿瘤细胞增殖,抑制肿瘤凋亡,并且可以通过调控其下游靶基因的表达,进而调节肿瘤的生长和侵袭。研究已证实,ATK信号通路的紊乱与肿瘤细胞的异常分裂和增殖有关,而且该信号通路能增加肿瘤组织的血管密度及提高肿瘤细胞的侵袭力。在结肠癌领域中,AKT信号通路也是研究热点。抑制ATK分子磷酸化可以有效防止结直肠癌细胞的增殖和转移,可作为结直肠癌的新型治疗手段[2]。我们的试验也表明,结肠癌干细胞组中AKT mRNA表达量明显高于对照组。

PTEN作为抑癌基因,其异常表达可存在于多种肿瘤细胞中。Rujuan SU等在收集了118个肿瘤病人的组织后,通过病理对照研究证实沉默PTEN基因会促使CD133阳性肿瘤干细胞中ATK信号通路表达异常活跃[3]。有研究显示,PTEN基因在结肠腺瘤形态发生和细胞蛋白异质性中起重要作用,与减少的大小,管状结构和高CD133阳性组件相关[4]。Eric C.Hales学者研究证实,过表达Notch1基因会使PTEN的表达受到抑制,抑制其表达会使PTEN的表达活跃[5]。这与我们的结果相吻合。

肿瘤的发生发展依赖多种细胞信号转导通路的共同作用。多位学者研究发现,Notch1信号通路能影响如Wnt、PDGF及AKT等信号通路的活性,过表达Notch1会引起ATK含量的升高,沉默Notch1会引起ATK含量的降低[6]。我们的实验结果也同样证实了上述结论,CD133+结肠癌干细胞组内Notch1表达增高,而同时ATK表达也同样增高。通过查找相关文献报道及初步试验,我们首先提出一种假设,PTEN基因可作为影响NOTCH-AKT通路中双向调控因子。

研究发现CD133+结直肠癌干细胞与ABCG2基因的表达密切相关,该基因是结直肠癌可能的治疗靶点。Andersen等学者在研究结直肠癌时发现病人癌组织中ABCG2的表达率是癌旁组织表达率的10倍,并表明 ABCG2基因的表达与结直肠癌的进展和转移密切相关[7]。沉默PTEN分子会使ATK信号通路活跃,同时活跃的ATK信号又会激发ABCG2分子的表达。本实验在分选出CD133+的结肠癌干细胞后,用实时定量PCR技术检测出ABCG2的mRNA表达量明显高于对照组。

综上所述,我们进一步提出假设:CD133+结肠癌干细胞中Notch1分子较对照组高表达,因此在干细胞中PTEN的表达会受到明显抑制,负向调节导致干细胞组的ATK分子的表达明显增高,进而

增加干细胞组ABCG2的表达量。即在结肠癌干细胞中可能存在Notch1-(PTEN)-ATK-ABCG2信号转导通路,干扰此信号通路中的每一个基因都有巨大的意义。我们也将对该信号通路进行更深入的研究。