原发性肝细胞肝癌PD-L1蛋白表达及在免疫治疗中的意义

林 蓁 杨文圣 尹可能

世界因肝癌致死的病例占恶性肿瘤死亡原发性的第3位，我国居第2位。每年约有25万人死于此病，其中约40%发生在中国[1]。通过阻断肿瘤细胞的免疫逃逸最终杀灭肝癌细胞的免疫治疗，可能是目前已知最具临床前景能较完全杀灭肝癌细胞的治疗手段。本文通过PD-L1检测探讨其在原发性肝细胞肝癌表达情况及在免疫治疗上意义。

1 材料与方法

1.1 材料

收集厦门大学附属成功医院2017年10月至2019年10月间，经病理诊断确诊为原发性肝细胞肝癌病例95例做测试组，其中男性77例，女性18例，年龄26～84岁，平均年龄56岁。 经病理诊断确诊为肝脏良性肿瘤病例20例做对照组，其中男性9例，女性11例，年龄22～83岁，平均年龄45岁。扁桃体组织10例及试剂盒内阳性、阴性细胞片做试剂内对照组。

1.2 主要仪器

Dako公司 Autostainer Link 48自动免疫组织化学染色仪 、全自动免疫组化预处理仪(PT Link，PT200)。

1.3 主要试剂

Dako公司EnVinsion FLEX(PD-L1 IHC 22C3)套装试剂盒：包括Linker Anti-Mouse、DAB Enhancer、VisualizationI Reagent-HRP、Monoclonal Mouseanti-PD-L1 Clone 22C3、Peroxidase-Blocking Reageagent、Negative Control Reagent、Target Retrieval Solution Low pH(50×)、DAB+Chromogen、DAB+Substrate Buffer、 Control Slides等试剂。

1.4 组织蜡块切片

取上述测试组、对照组组织蜡块，将蜡块3 μm切片各两张，裱在防脱载玻片上，所有蜡块均分蜡块检测组、蜡块阴性对照组，组织切片65 ℃烤片30 min，二甲苯脱蜡，经梯度乙醇至水化后待用。

1.5 免疫组织化学染色

1.5.1 免疫组织切片抗原修复 使用Dako 全自动免疫组化预处理仪，进行组织切片及细胞片抗原修复。程序：根据编辑程序打印相关条形码，蜡块测试及蜡块阴性对照片各一张，每例病例分组贴好不同条形码。将EDTA (pH 9.0，50×)组织修复液装入自动免疫组化预处理仪中扣上仪器盖，按启动键将修复液加热预温到65 ℃后，打开仪器盖将组织切片及细胞片浸没入修复液中，继续启动预处理程序进行98 ℃ 20 min的抗原修复；程序结束后，将组织切片及细胞片pH 7.2～7.4 PBS缓冲液洗涤3 min，蒸馏水洗涤1 min。

1.5.2 免疫组化PD-L1(22C3)蛋白检测 使用Dako Autostainer Link 48自动免疫组织化学染色仪，Dako EnVinsion FLEX(PD-L1 IHC 22C3)套装试剂盒上机检测(室温22～25 ℃)，染色主要步骤：将已经修复好的组织切片及细胞片上机扫描开始染色，内源性过氧化物酶封闭5 min，pH 7.2～7.4 Buffer冲洗；一抗PD-L1(22C3)室温孵育30 min(阴性对照片不需要加一抗)，pH 7.2～7.4 Buffer冲洗1 min；二抗室温孵育30 min，pH 7.2～7.4 Buffer冲洗1 min；VisualizationI Reagent-HRP室温孵育30 min，pH 7.2～7.4 Buffer冲洗1 min；DAB室温显色5 min×2；pH 7.2～7.4 Buffer冲洗1 min；扩大剂室温5 min；pH 7.2～7.4 Buffer冲洗1 min；苏木精复染 1 min，无水乙醇脱水，电吹风微风吹干，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.6 统计学方法

应用SPSS 21.0统计软件分析，比较肝脏良、恶性肿瘤检测阳性百分率差异性，计数资料采用卡方χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

由2名高年资医师共同判读结果，PD-L1(22C3)免疫组化标记阳性定位在肿瘤细胞膜，实验根据肿瘤比例评分(TPS)为判读标准，指部分或完整膜染色的肿瘤细胞占样品中存在的所有活肿瘤细胞的百分比(PD-L1染色阳性肿本组瘤细胞数/总活肿瘤阴性和阳性细胞数)，判读中应排除任何免疫细胞、基质细胞、坏死细胞的阳性表达。判读前，先对扁桃体组织、阳性、阴性细胞片及蜡块阴性对照片等进行评估，符合质控标准后，再继续进行判读。测试组cutoff值，TPS≥1%为阳性，有9例，其中PD-L1高表达，有2例；TPS：1%～49%低表达，有5例。cutoff值，TPS<1%或无肿瘤细胞表达PD-L1蛋白为阴性，有87例。 PD-L1蛋白阳性表达及表达强度，与肿瘤分化程度无明显相关性。对照组：20例良性病例，cutoff值TPS<1%或无肿瘤细胞表达PD-L1蛋白，均为阴性。测试组与对照组，PD-L1蛋白检测阳性表达差别显著，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

相关肝细胞肝癌PD-L1研究的文献不少，免疫组化检测PD-L1作为肝细胞肝癌的免疫治疗生物学靶点是很有前景[2]。目前针对PD1/PD-L1通路阻断剂在肝癌治疗中的作用的临床研究亦很多，研究编号有：NCT02576509、NCT02837029、NCT02702401、NCT0265-8019等[3]。有Truong等[4]有相关报道，一老年男性转移性HCC患者，Sorafinib治疗后失败，接受6个周期Pembrolizumab治疗后，肿瘤大小明显减小，甲胎蛋白明显下降，此类病例提示Pembrolizumab等免疫治疗有望为晚期HCC患者带来新的福音。

PD-L1表达水平目前是受到广泛认可的PD1/PD-L1抑制剂疗效预测标志物，但PD-L1检测存在缺乏一致性与检测金标准的缺陷[5]。肝细胞肝癌PD-L1靶向治疗的伴随诊断判读阈值等亦尚未达到比较统一的标准，目前有文献在肝细胞肝癌采用其它肿瘤的评判标准[2]。不同药商厂家使用免疫治疗药物进行临床试验时，采用不同厂家PD-L1抗体，并在不同平台上进行，没有统一的抗体型号、统一标准的检测平台、统一的标准化试剂盒。由于PD-L1抗体类型的多样性，国内使用的PD-L1抗体有多个克隆号包括22C3、SP142、SP263、73-10等，染色方法和染色平台也缺乏规范化和统一性。PD-L1的表达与免疫治疗的疗效显著相关，可作为筛选免疫治疗潜在获益人群的一项指标，由此获得准确、可靠的PD-L1检测结果对免疫治疗的选择至关重要[6]。为了节约极为有限的肿瘤标本，节约检测费用与检测次数，缩短无意义重复检测所耗费的时间，临床迫切希望得到各检测抗体之间的相关性及一致性研究结果，从而使PD-L1检测的临床应用及其治疗决策的指导变得更为简便[7]。

由于免疫治疗抗PD-L1药物需要应用于临床与治疗主要依据免疫染色相关的PD-L1检测结果，因此PD-L1检测更需要提高其规范化和重复性。关于PD-L1检测，需要专门的检测平台，专门克隆号的抗体及配套的试剂盒，专门的培训及规范的检测流程。本次实验我们选择Dako North America 的“PD-L1”(22C3)检测试剂盒(免疫组化法)，这也是目前在中国获批的PD-L1检测试剂盒。其中抗体22C3，常作为其它抗体的参照法[2]。同时我们使用与之配套的检测平台Dako Autostainer Link 48免疫组化染色仪，这也从最基础前提上保证实验检测的可行性，结果准确的基本保证。

22C3抗体染色肿瘤组织，以任意膜染色强度(≥1%)为阳性指标，根据肿瘤比例评分(TPS)的3个等级(TPS<1%：PD-L1不表达；TPS 1%～49%：PD-L1低表达；TPS≥50%：PD-L1高表达)作为Pembrolizumab的用药指标[8]。不同医师判读结果可能导致不同的治疗选择，因此真实临床实践中应加强规范化检测、严谨统一的判读标准及对病理医师进行判读标准的培训[6]。结果的判读在光学显微镜下观察，先确定阴性、阳性对照表达定位正确清晰易辨，才可对检测标本进行判读，作为对照组的扁桃体组织PD-L1标记要求不同程度中等强度的表达。对肿瘤细胞数量较少的穿刺标本，判读的肿瘤细胞必须不少于100个。对定位或显色不正确的病例应重新进行标记，如周边效应。目前PD-L1检测主要在组织标本上进行，因其表达具有异质性，检测时应优先选择手术标本；如果患者不能进行手术切除，也可考虑穿刺组织标本；当肿瘤发生复发或转移的，选择复发或转移的标本。实验肝细胞肝癌PD-L1的检测结果显示，PD-L1表达于阳性病例中有高分化、中分化及低分化病例，PD-L1强度与肿瘤分化程度无明显相关性，低分化病例PD-L1表达不一定强阳性，高分化PD-L1表达也不一定弱阳性。

为保证实验质量进行反复预试验，需有经过一定数量的组织检测，优化程序以探索最佳的染色方案。我们使用Autostainer Link 48自动免疫组织化学染色仪，及 Dako EnVinsion FLEX(PD-L1 IHC 22C3)套装试剂盒，为实验规范化提供最基础的保障。全自动免疫组化预处理仪(PT Link，PT200)对组织切片进行98 ℃ 20 min组织抗体修复，效果较佳。免疫组化程序中DAB显色进行2次重复显色步骤，既保证显色充分也防止DAB非特异性颗粒吸附，效果较单次DAB显色佳。本文通过对原发性肝细胞肝癌进行PD-L1规范化免疫组化标记，了解PD-L1在原发性肝细胞肝癌中表达的特征，这将对临床在原发性肝细胞肝癌的免疫治疗研究具有十分重要的意义。