HPLC法测定清咽丸中靛蓝的含量

冯娟，郭均怡，覃亮*

（1.广东食品药品职业学院，广东广州 510520；2.肇庆学院食品与制药工程学院，广东肇庆 526061）

清咽丸主治功能为清热利咽、生津止渴，常用于肺胃热盛所致的咽喉肿痛、声音沙哑、口舌干燥、咽下不利等症状，缓解咽部不适。青黛作为清咽丸的成分之一，其性咸、寒，无毒，入肝、肺、胃经，具有清热凉血、解毒消斑、清肝去火、定惊等功效[1]。在医学研究方面，研究发现青黛含有靛蓝、靛玉红、青黛酮、β-谷甾醇、色胺酮等有效成分[2-5]，其中靛蓝是一种衍生自前体物吲哚的芳香族化合物，在天然植物中提取出来的植物靛蓝具有清热解毒、消斑、止血、抗炎、抗衰老、抗疲劳、抗癌、保肝等作用[6]。虽然青黛在清咽丸中起着清热解毒、缓解肝火所致的咽喉肿痛的重要作用，但在药典以及其他文献均没有关于青黛在清咽丸中的定量指标，本研究根据《中国药典》2015版一部和对中成药中靛蓝进行含量测定的相关文献[7]，对清咽丸中的靛蓝进行含量测定方法探究和验证，以更好地控制产品质量，保证发挥药品主要功效。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

LC-20A高效液相色谱仪，岛津企业管理（中国）有限公司；XS205DU电子天平（十万分之一），METTLER TOLEDO公司；KO-500E超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；UPR-IV-20T优普系列超纯水机，四川优普超纯科技有限公司；UV-2450紫外分光光度计，日本岛津公司。

1.2 试剂

清咽丸（大蜜丸）购于北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号17010634、17013112、16022745；靛蓝对照品购于中国食品药品检定研究院；高效液相色谱仪所用乙腈为色谱纯，广州化学试剂厂；N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙酸乙酯、氯仿均为分析纯，广州化学试剂厂，所用水为超纯水。

1.3 溶液配制

1.3.1 对照品溶液的制备

用电子天平精密称取靛蓝对照品2.51 mg置于50 mL棕色容量瓶中，加入适量N,N-二甲基甲酰胺超声使靛蓝对照品完全溶解，待冷却至室温后加入N,N-二甲基甲酰胺稀释定容至刻度线，摇匀即得浓度为50.2 μg/mL的靛蓝对照品母液。从母液中精密吸取4 mL置于10 mL容量瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺稀释定容至刻度线，即得浓度为20.1 μg/mL的靛蓝对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液的制备

取清咽丸（批号17010634）足量，剪碎并混匀，精密称取适量剪碎的药品于铜盅，同时精密称取相同质量的硅藻土置于铜盅，研匀至细密均一、颜色一致、无大颗粒状态，即为样品。精密称取3 g样品于100 mL带塞锥形瓶中，加入25 mL N,N-二甲基甲酰胺，精密称定整体质量，避光，超声30 min，取出并冷却至室温后精密称定质量，加入N,N-二甲基甲酰胺补足失重，摇匀，取粗滤液适量，用0.45 μm滤头滤过，取适量滤液作为供试品溶液。

1.3.3 阴性溶液的制备

按照清咽丸处方进行药材配比，除青黛之外的其他八味药材，粉碎成细粉，过5号网筛（80目）混匀备用。按照1.3.2项下的方法，制成缺少青黛的阴性样品溶液，用0.45 μm滤头滤过，取适量滤液作为供试品阴性溶液。

1.4 色谱条件

色谱柱为Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μL），以十八硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈∶水=42∶58，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，泵压≤25 MPa，定量方法为外标法，进样量10 μL，检测波长286 nm，理论塔板数按靛蓝峰计算应不低于3 000。

2 结果与分析

2.1 专属性考察

吸取清咽丸供试品溶液、靛蓝对照品溶液以及阴性样品溶液各10 μL，分别注入色谱仪，确定清咽丸除青黛这个药材含有靛蓝外无其他药材成分干扰（图1），故该法可以进行清咽丸中靛蓝含量的测定。

图1 高效液相色谱图

2.2 线性关系考察

配制浓度为 12.6 μg/mL、15.1 μg/mL、20.1 μg/mL、25.1 μg/mL、30.1 μg/mL、50.2 μg/mL的靛蓝对照品溶液，分别吸取10 μL溶液注入液相色谱仪，在“1.4”色谱条件下进行检测，以对照品浓度（μg/mL）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制出靛蓝对照品的标准曲线得到回归方程Y=54 687X-41 567，R2=0.9998，图2表明靛蓝在12.6～50.2 μg/mL范围内呈现良好的线性关系。

图2 不同浓度靛蓝的出峰线性关系图

2.3 精密度试验

取浓度为20.1 μg/mL的靛蓝对照品溶液在“1.4”色谱条件下连续进样6次。2015版中国药典规定，含量测定方法学验证中，精密度试验的相对标准偏差RSD需在3%范围内。本次实验结果显示，连续进样6次的峰面积大小相近，峰面积分别为1 050 872、1 050 550、1 050 695、1 050 350、1 050 959、1 050 540，RSD=0.12%，说明方法精密度良好。

2.4 稳定性试验

精密量取供试品溶液，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h按照“1.4”色谱条件进行靛蓝含量测定。结果显示，不同时间段检测靛蓝的峰面积 为 1 108 006、1 106 491、1 105 664、1 104 983、1 104 532、1 103 074、1 098 996、1 098 600，平均值为1 103 791，RSD=0.31%（n=8），说明本品制备后24 h内稳定。

2.5 重复性试验

在“1.3.2”条件下制备6组重复性供试品溶液，按照“1.4”色谱条件进行靛蓝含量测定。从实验结果可知，清咽丸中靛蓝的含量分别为2.019 1 mg/丸、2.000 7 mg/丸、2.005 7 mg/丸、2.010 2 mg/丸、2.018 4 mg/丸、2.002 9 mg/丸，平均值为2.009 5 mg/丸，RSD=0.78%，相对标准偏差较小，在药典规定含量测定方法学验证中关于重复性试验相对标准偏差不大于3%的范围内，说明此方法重现性良好。

2.6 加样回收试验

取6份供试品进行加样回收率试验。对照品的加入量与样品中靛蓝含量之和在标准曲线的线性范围内，结果显示同一批次的6份供试品溶液检测得到的靛蓝回收率分别为99.23%、98.89%、99.14%、99.49%、100.11%、100.13%，平均回收率为99.50%，RSD=0.52%，所测得的回收率结果均在药典规定范围内，表明此含量测定方法可行。

2.7 供试品含量测定

取3个不同批次的供试品按照“1.3.2”制成供试品溶液，在“1.4”色谱条件下进行含量测定。如表1所示，3个不同批次的清咽丸中靛蓝含量稍微不同，但其RSD均较小，说明此测定方法稳定且可行性高。

表1 3组不同批号清咽丸中靛蓝的含量

3 结论

通过实验，确立了利用高效液相测定清咽丸中靛蓝含量的方法，此方法高效便捷，可以快速有效地检测出清咽丸中靛蓝的含量，方法精密性、稳定性、重现性均良好，证明本实验方法可有效地监测清咽丸的质量。