转录终止子对麦芽糖淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中表达的影响

楼志华

（江苏省奥谷生物科技有限公司，江苏溧阳 213300）

随着细菌的研究深入到分子遗传层面，细菌RNA聚合酶（RNAP）终止转录的机制一直是基因表达研究的重点。在基因表达的调节中，对转录终止过程的调节是最重要的环节之一[1-2]。转录终止的分子基础是DNA和蛋白质的相互作用，RNA转录物中形成的特定结构会使转录复合物不稳定，目前将这样造成的转录终止归纳为两种机制：内在型和因子依赖型[3]。因此，转录终止子是和启动子同样重要的表达元件。目前，对于启动子鉴定及改造的研究已广泛开展，而对转录终止子的认识有限。现有对细菌转录终止子的认识主要来源于对大肠杆菌的研究。芽孢杆菌作为重要的工业微生物，虽然在生产中已被广泛使用，但其分子遗传仍处于起步阶段[4-5]。尤其是在转录终止元件的鉴定方面，目前还鲜有报道。本研究基于地衣芽孢杆菌基因组信息，预测并鉴定了不同的转录终止子。进一步通过考察不同终止子对淀粉酶报告基因表达的影响对其特性进行了评价。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒和培养基

实验中用到的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600、大肠杆菌Escherichia coli JM109均为本实验室所保藏。LB培养基、TB培养基均依照文献配置[1]，重组大肠杆菌培养基中添加100 μg/mL氨苄青霉素，重组芽孢杆菌转化子培养基中添加20 μg/mL四环素，枯草芽孢杆菌转化用培养基依照文献配置[2]。

1.2 试剂与仪器

限制性内切酶，美国Fermentas公司；T4DNA连接酶、Ex taq DNA连接酶，大连Takara公司；质粒提取试剂盒、核苷酸片段纯化试剂盒、胶回收试剂盒，Axygen公司；氨苄青霉素、四环素，生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母粉、蛋白胨，OXOID（美国）公司；其他常用试剂药品均来自于国药集团（上海）有限公司。

UV2000紫外可见分光光度计，美国UNICO公司；HB-100恒温金属浴，杭州博日科技有限公司；GNP-9080隔水式恒温培养箱，上海精密实验设备有限公司；Delta 320型pH计，瑞士Mettler-Toledo 公司；Waters 2695高效液相色谱仪，美国沃特斯公司。

1.3 重组表达质粒的构建

PCR扩增获得连接六种转录终止子的目的片段，载体为pHY300并用NruI单酶切。连接体系（20 μL）为：目的片段 14 μL，载体2 μL，T4连接酶 2 μL，Buffer 2 μL。放置16 ℃金属浴中连接16 h，获得T1～T6六种重组质粒。

1.4 枯草芽孢杆菌的转化及筛选

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法及筛选方法参照文献进行[3]。

1.5 重组海藻糖合成酶的诱导表达

将重组枯草芽孢杆菌接种于20 mL LB培养基中，在37 ℃、200 r/min的摇床中振荡培养，以此作为种子液。过夜培养的种子液以3%（V/V）的接种量接种于30 mL TB发酵培养基中，于37 ℃、250 r/min的条件下培养8 h后，加入终浓度为1.0%（w/w）的30%木糖，于30 ℃、250 r/min的条件下诱导发酵16 h。对于胞内表达麦芽糖淀粉酶的重组菌，将发酵液于12 000 r/min、4 ℃条件下冷冻离心收集菌体，收集上清液，上清液即为粗酶液。麦芽糖淀粉酶活力的检测参照文献进行[3]。

2 结果与分析

2.1 重组表达质粒的构建

从NCBI基因数据库中分别预测得到6种芽孢杆菌来源的不同转录终止子序列，如表1所示。将构建的质粒pHY300用NruI单酶切得到载体，构建的质粒pHY-BLMA分别用6种终止子PCR扩增得到目的片段，将PCR产物纯化后与载体连接得到重组质粒，转化E. coliJM109，挑取转化子进行菌落PCR验证。验证正确的转化子接种于液体LB培养基后提取质粒，得到了可以表达淀粉酶基因的重组质粒。图1为PCR扩增后得到的目的片段的电泳验证图，目的片段大小约为2 000 bp。图2为重组质粒导入E. coliJM109中，对长出的转化子进行菌落PCR鉴定的电泳验证图。

表1 转录终止子的预测

图1 终止子PCR电泳图

图2 菌落PCR电泳图

2.2 重组表达质粒在枯草芽孢杆菌中的表达

以野生菌为对照，测定野生菌、原始菌以及重组菌的菌体量、蛋白浓度、粗酶液的酶活，结果如表2所示。

根据表2中的重组菌株的数据，发现野生菌没有酶活，而原始菌以及重组菌均有酶活，说明在原始菌及重组菌内都有淀粉酶的表达。发酵24 h后野生菌的菌体量最多，而重组菌的菌体量相对于原始菌的较少，但重组菌的蛋白浓度有所提高，酶活有小幅度的增加，单位菌体量上的酶活有较大的提高。由于酶活提高的程度不大而蛋白浓度又有增加，使得单位蛋白的酶活有所降低。重组菌中，生长最好的菌株是B.subtilis WB600（T1）；蛋白浓度最高的是B. subtilis WB600（T6），最高达到0.885 g/L；酶活力最大的是B. subtilis WB600（T5），最高达到 161.49 U/mL；单位菌体酶活最高的是B. subtilis WB600（T5），可达到22.24 U/mL；单位蛋白酶活最高的是B. subtilis WB600（T4），最高达到306.71 U/mL。

表2 重组菌的表达

3 结论

从NCBI数据库中预测了芽孢杆菌来源的6个不同的转录终止子，以淀粉酶为报告基因，考察他们对目的基因表达的影响。结果显示，所预测的6个基因均可以介导目的基因的功能表达，表明他们具有应用为新的表达元件的潜力。