ClO-识别的稀土荧光探针的合成及性能研究

苏仙桃 杨浩 张曼

摘 要：以硝酸铕、荧光素、2-甲氧基苯甲醛、水合肼作为原料合成稀土荧光探针（FP）。使用核磁、红外对稀土荧光探针（FP）进行表征，确定探针中酚羟基和饱和甲基中氢的位置和稀土铕与探针1：3络合存在。通过荧光光谱仪测试探针对次氯酸根离子的检测能力，较SO42-、Cl-、CO32-、NO2-、CH3COO-、NO3-，探针对ClO-表现出了较强的选择性，随着次氯酸根浓度的逐渐增加，荧光强度呈线性增强（R2=0.9949）。对探针的实时检测性能进行研究表明：该探针荧光响应时间为2min，在pH=6-8溶液中荧光强度达到最大且数值变化很小。表明该稀土荧光探针可用于ClO-高选择性、高灵敏度的检测识别。

关键词：荧光素;稀土荧光探针;荧光探针;次氯酸根

中图分类号：O614  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2021）12-0010-05

1 引言

次氯酸盐消毒剂是最早在世界上广泛使用的消毒剂，次氯酸盐消毒剂不仅广泛使用于日常生活，而且经常被用来进行灾后的消毒杀菌。例如地震、洪水、化学事故等的地区，使用量巨大，使用单位多，使用面积广阔。次氯酸盐使用浓度超出一定范围会成为潜在污染物，危害自然界甚至人类。因而，高灵敏度检测环境和生命中的次氯酸盐对相关疾病的早期预测具有重要意义。

戴志超[1]以5-羧基四甲基罗丹明、邻苯二胺、DCC、4-二甲氨基吡啶、4′-溴甲基-2，2′， 6′，2″-联三吡啶-6，6″-二甲胺四乙酸乙酯及TbCl3为原料得到探针TR-NO。探针TR-NO选择I565/I540作为荧光强度比值与不同浓度的NO溶液反应浓度从5.0μmol/L逐渐增加到400μmol/L时，溶液的I565/I540增强约27.8倍，表明该探针TR-NO对NO具有优秀的比率时间分辨荧光响应。

李漫[2]等人使用4-二苯氨基苯甲醛、水合肼合成识别ClO-的比率型荧光探针4-（肼基亚甲基）-N，N-二苯基苯胺（LM1），在乙醇-PBS的体系中，与ClO-反应后，肉眼可见溶液由浅黄色变成无色，在紫外光下溶液由亮黄色逐渐变暗，因此可裸眼识别次氯酸根。与其他离子共存时，测试结果不受干扰。

吴拥军[3]等人以荧光素、二氯乙烷、三氯氧磷、乙腈、2-甲氧基苯甲酰肼、三乙胺为原料得到2-甲氧基苯甲酰肼荧光素内酰胺。该化合物本身无色无荧光，当加入NaClO溶液后，明显产生绿色荧光，其他分子不能使之产生荧光。因此证明荧光素酰肼是对NaClO具有高的选择性、专一性灵敏性识别的探针。

姚书帆[4]等人以亚甲基蓝（MB）为荧光母核，N，N-二甲基苯胺、二氯甲烷、连二亚硫酸钠、Na2CO3 等为原料，合成了一种用于HOCl特异性检测的近红外荧光探针MB-1，该探针在检测HOCl之后荧光强度增强，并且溶液颜色从无色变成蓝色。该探针对HOCl具有较高的灵敏度，较好的抗干扰能力，为在生理水平上检测HOCl提供了可能。

张伟杰[5]等人以香豆素为母体单元，4-（二乙胺基）水杨醛、乙酰乙酸乙酯、无水乙醇、二氯甲烷，巯基乙醇和甲基磺酸为原料合成了比率型次氯酸荧光探针。与次氯酸作用后荧光和紫外都产生明显变化，无色溶液变为黄绿色溶液，能够实现荧光检测和裸眼识别。其他常见物质对次氯酸的检测均未产生干扰。因此探针拥有优异的选择性、较高的灵敏度以及较宽的pH值响应范围。

汪文杰[6]等人以荧光素为荧光团，C=N为识别基团，使用4-（二乙氨基）水杨醛和荧光素酰肼得到荧光探针（FD）。该荧光探针探针具有高的灵敏度和选择性对于次氯酸的荧光分析，同时具有较低检出限。实现了次氯酸在HeLa活细胞中的可视化荧光成像。

韩志湘[7]等人选择7-二乙胺基香豆素-3-羧酸为母体，无水乙醚、2，4-二硝基苯肼、三乙胺为原料得到荧光探针分子。结果表明：与次氯酸反应荧光显著增强，同时溶液从无荧光变为蓝色强荧光。对次氯酸表现出特异性识别且响应速度快，成功用于活细胞内HOCl的可视化检测。

邢又元[8]等人使用香豆素醛与萘酰亚胺双荧光团合成了一种比率型荧光探针。C=N双键将香豆素醛与萘酰亚胺连接后增加了探针整体的共轭度而产生黄绿色荧光。加入次氯酸根后，探针会氧化水解为蓝色荧光的香豆素醛，实现对ClO-的比率监测。

贾斌[9]等人以水合肼、甲醇、二氯甲烷、三乙胺、丹磺酰氯、2-（4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基）苯甲酸为原料得到荧光探针（CuP1）。单独的CuP1溶液荧光发射信号非常微弱，加入Cu2+后溶液荧光发射明显增强，同时溶液从无色变为红色，实现了铜离子的裸眼识别。同等条件下，加入其他金属离子后荧光光谱几乎没有变化。实验结果证明了探針对Cu2+专一的选择性。

丁娜[10]等人以2-羟基-1-萘甲醛为起始原料，通过两步反应，合成出了新型荧光探针L以2-（苯并噻唑-2-基）萘酚为荧光团，7-硝基-2，1，3-苯并氧杂嗯二唑（NBD）为识别基团。该探针可对H2S进行专一性识别，探针L在pH为6.05～8.18的范围内对H2S表现出高灵敏性、高选择性。

王莎[11]等人选择芘甲醛、二氯亚砜、邻氨基苯甲酸、N，N-二甲基甲酰胺、石油醚为原料设计合成了一种对Fe3+特异性响应的荧光探针芘甲酰邻氨基苯甲酸（PAA）。结果表明：PAA对Fe3+具有高选择性、高抗干扰性的荧光响应。随着Fe3+浓度的升高，探针的荧光强度逐渐减弱﹐同时伴随大量Fe3+螯合物沉淀的析出，从而使Fe3+从体系中富集出来，且在4倍浓度干扰离子存在的体系中，PAA对Fe3+的识别能力几乎不受影响。

李爱玲[12]等人以高半胱氨酸、罗丹明、水合肼、二氯甲烷、乙酸乙酯、NaH2PO4、三氯化铝，4-羟乙基哌嗪乙磺酸等为原料合成探针Hcy-RH6G2。通过对其荧光光谱性能，pH影响，选择性，性能，机理等进行研究。探针分子可以在HEPES缓冲溶液中快速地、有选择性地识别Hg2+，具有较好的线性关系。可在较宽的pH内（pH=6.2～12.0）对Hg2+进行高灵敏、高选择性地检测。

张璐[13]等人以乙酰乙酸乙酯、间苯二酚、二氯甲烷、正丁硫醇、三氟化硼、二乙基醚化物等为原料合成香豆素二硫缩醛荧光探针（L1）。通过对探针选择性识别Hg2+的机理，抗干扰性等研究得：该探针对Hg2+荧光检测具有高选择性，能应用于真实水样中Hg2+的痕量检测。

本实验中选择荧光素为母体，之后邻甲氧基苯甲醛修饰。鉴于稀土荧光探针的时间分辨荧光分析技术可有效消除背景荧光干扰，呈现出高灵敏度的分析价值，合成拥有选择性识别和荧光响应功能的稀土荧光探针。基于ClO-氧化性，来实现荧光性能的开关转变，作用于ClO-荧光分析检测。

2 实验药品与仪器

2.1 实验药品

荧光素，分析纯，中国医药集团有限公司;水合肼，分析纯，中国医药集团有限公司;无水乙醇，分析纯，天津恒兴集团有限公司;邻甲氧基苯甲醛，化学纯，西亚化学科技（山东）有限公司;乙腈，液相色谱淋洗液，中国医药集团有限公司;硝酸铕，分析纯，西亚化学科技（山东）有限公司;次氯酸钙，分析纯，沈阳市华东试剂厂;氯化钾，分析纯，沈阳市华东试剂厂;无水碳酸钠，分析纯，天津市河东区红岩试剂厂;亚硝酸钠，分析纯，中国医药集团有限公司;乙酸锌，分析纯，天津恒兴;硝酸铝，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司;硫酸镁，分析纯，沈阳市华东试剂厂。

2.2 实验仪器

循环水式真空泵，SHD-（III），河南予华仪器有限公司;三用紫外分析仪，ZF-1，北京炳洋科技有限公司;数字超声波清洗器，KQ-800DE，昆山市超声仪器有限公司;真空干燥箱，DZF-6020AF，天津工兴实验室仪器有限公司;荧光分光光度计，F97，上海棱光技术有限公司;傅立叶变换红外光谱仪，Nicolet iS5，美国Thermo fisher;数字熔点仪，WRS-1B，上海仪电物理光学仪器有限公司。

3 实验部分

3.1 探针合成路线

3.1.1 中间体荧光素肼的制备

取一个100mL的蒸馏烧瓶，加入1.5g荧光素固体粉末，使用40mL的无水乙醇进行溶解。再量取6mL的水合肼，磁力搅拌下缓慢加入，30分钟内滴加完毕。加热至80℃，保持温度持续加热回流12h。反应期间使用薄层色谱法（TLC）追踪反应进程。回流结束后，将液体冷却至室温，设置40℃左右真空旋转蒸发去除溶剂无水乙醇。然后向旋蒸结束后的溶液加入100mL的蒸馏水，有明显絮状物质产生，静置后底部有沉淀产生。将溶液抽滤，多次用水洗涤，洗涤到滤液无色，进行真空干燥后得到米白色固体质量为1.3041g，产物的产率为86.94%。测得中间体熔点为262～264℃。

3.1.2 稀土荧光探针的制备

称量1.038g（3mmol）中间体2荧光素肼放入到100mL的蒸馏烧瓶中，加入20mL的无水乙醇进行溶解。向其中滴加30mL无水乙醇溶解的邻甲氧基苯甲醛（4.5mmol，0.612g）溶液，十分钟左右滴加完毕继续加入由10mL无水乙醇溶解的硝酸铕（1.5mmol， 0.669g）。加热回流6h。反应期间也要使用薄层色谱法（TLC）追踪反应进程。回流反应结束后，将溶液转移到干净的小烧杯中冷却结晶，之后进行抽滤，得到产物荧光探针质量为0.8407g，熔点为303～307℃。

3.2 稀土荧光探针溶液的制备和检测

称取0.0616g荧光探针固体，使用乙腈配制成为浓度1mmol·L-1的贮存液，冷藏保存，待使用时稀释到适应浓度。其他阴离子SO42-、Cl-、CO32-、NO2-、CH3COO-、NO3-、ClO-、的标准溶液都配制为浓度2000μmol/L的溶液，依照实验需要使用。实验所用药品均为分析纯，实验用水均为蒸馏水。

3.3 结果与讨论

3.3.1 稀土荧光探针核磁共振氢谱数据

使用氘代DMSO为溶剂对探针进行核磁氢谱扫描。1HNMR（DMSO，400MHz）：δ（ppm）3.73（s，3H），4.45（s，1H），6.50（m，4H），6.69（d，2H），6.89（t，1H），6.97（d，1H），7.11（d，1H），7.31（td，1H），7.46（dd，1H），7.61（m，2H），7.92（m，1H），9.18（s，1H），9.99（s，1H）。经过核磁氢谱数据，3.75（s，3H）3个H是饱和甲基的氢，9.18（s，1H），9.99（s，1H）这两个H是酚羟基的氢。从图中可看出共有20个氢，我们可以判断该化合物为我们的目标产物。

3.3.2 稀土荧光探针红外光谱数据

在4000-500cm-1范圍内测定了荧光探针和及稀土荧光探针的红外光谱，见图4，荧光探针在3430cm-1和1470cm-1处的峰分别归属为酚羟基O-H单键和饱和甲基C-H单键吸收峰，当加入稀土元素铕后，酚羟基O-H单键和饱和甲基C-H单键均受到影响。我们可以看到在3430cm-1的吸收峰发生红移，1470cm-1处的吸收峰发生蓝移。这是因为当形成稀土荧光探针后，酰胺和饱和甲基都受到稀土离子铕影响吸收峰发生偏移。可以判定探针中有稀土元素铕并且以离子形式与探针1：3的配位存在。

3.5.3 探针对次氯酸根的选择性识别

荧光探针的选择性、专一性识别是鉴定荧光探针检测次氯酸根性能的至关重要的一步。荧光探针浓度固定为5μmol/L，加入配制好的同浓度干扰阴离子标准溶液SO42-、Cl-、CO32-、NO2-、CH3COO-、NO3-、ClO-。

图5为荧光探针中加入不同干扰离子和次氯酸根的荧光光谱黑色条为荧光探针对各种干扰离子的荧光响应情况。红色条为加入次氯酸根后，荧光探针对各种干扰离子的荧光响应情况。结合图6荧光探针中加入干扰离子和次氯酸根的荧光强度变化可以看出，在其他干扰离子的存在下，荧光探针检测次氯酸根几乎没有影响。证明该荧光探针对次氯酸根有良好的选择性、专一性识别。

3.3.4 探针对次氯酸根的荧光滴定

荧光素有两种异构体分别为不产生荧光的螺环结构和可以产生强荧光的开环结构，大部分荧光素衍生物对生物小分子的识别机理都是建立在螺环结构的开环变化基础上。从下图中可以看出，由于荧光素母体内酯式结构的存在，探针本身几乎没有荧光，与ClO-反应后被氧化开环，生成氯代产物，进一步脱氯得到最终产物，无论氯代产物，还是脱氯后的产物都能产生强荧光，实现了荧光从无到有的变化。

图7为荧光探针检测不同浓度次氯酸根荧光光谱。固定荧光探针溶液浓度为5μmol/L，分别配制浓度为3μmol/L、6μmol/L、9μmol/L、12μmol/L、15μmol/L、18μmol/L的次氯酸钙溶液。将激发波长调为534nm，用荧光光度计分别测定以上6种不同浓度溶液的荧光值，从图中可以看出，探针本身几乎没有荧光，随着次氯酸根浓度的递增，荧光强度增强。

右上角为次氯酸盐浓度与荧光强度线性关系图。在激发波长为534nm处，不同浓度次氯酸根与荧光探针的荧光强度具有线性关系。线性方程为y=7.7x+758.5（线性度R2=0.99485），因此，此荧光探针可用以次氯酸根的定量检测，如图8所示。

3.5.5 不同pH值对荧光光谱的影响

为了探讨环境和生物体的酸碱性对荧光探针实际应用的影响，研究了探针的荧光值与pH值之间的关系。荧光探针浓度固定为5μmol/L，ClO-的浓度为20μmol/L。图9所示为，当荧光探针中不加入次氯酸根时，荧光探针对于pH的响应非常弱，但在加入次氯酸根后，溶液的荧光强度达到最大是在pH=6～8之间，且数值变化很小。因此，体系pH=6～8是该荧光探针最佳应用范围。

3.5.6 反应时间对荧光强度的影响

为了研究该探针的检测性能，荧光探针浓度固定为5μmol/L，ClO-的浓度为20μmol/L，对其不同时间下的荧光性能进行检测，从图10可以看出，荧光强度急剧增大，在2min后，几乎达到最大值。说明该探针具有对ClO-实时监测的特点。

4 总结

本实验以硝酸铕、荧光素、2-甲氧基苯甲醛、水合肼作为原料合成稀土荧光探针（FP）。鉴于稀土荧光探针的时间分辨荧光分析技术可有效消除背景荧光干扰，呈现出高灵敏度的分析价值，合成拥有选择性识别和荧光响应功能的稀土荧光探针（FP）。通过對稀土荧光探针自身以及添加不同浓度次氯酸根的稀土荧光探针进行荧光测定，稀土荧光探针自身荧光强度很低，随着次氯酸根浓度的逐渐增加，荧光强度逐渐增强（线性方程为y=7.7x+758.5）。使用干扰离子SO42-、Cl-、CO32-、NO2-、CH3COO-、NO3-检测，在干扰离子存在下，稀土荧光探针的荧光强度变化很小，加入次氯酸根后荧光强度显著增强，因此干扰离子对于稀土荧光探针检测次氯酸根没有影响，该探针对次氯酸根有良好的选择性、专一性识别。对探针的实时检测性能进行研究，稀土荧光探针荧光时间响应为2min说明该探针具有对ClO-实时监测的特点。研究环境和生物体的酸碱性对荧光探针实际应用的影响，测定加入次氯酸根前后的溶液对pH值的响应，在pH值为6～8的溶液中荧光强度达到最大，且数值变化很小。结合以上实验结果说明该稀土荧光探针可用于ClO-高选择性、高灵敏度的检测识别。

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