枳壳挥发油抑菌活性的谱效关系

张智敏 阚雨村江豪杰李亚梅 严建业林丽美*罗 堃*

(1.湖南中医药大学药学院,湖南 长沙 410208;2.湖南中医药大学,湘产大宗药材品质评价湖南省重点实验室/湖南省中药不良成分快速检测及脱除工程技术研究中心,湖南 长沙 410208)

枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的未成熟果实,有效成分主要为生物碱、黄酮、挥发油,具有破气消积、化痰散痞的功效[1],其中挥发油是枳壳理气、行滞、镇咳、祛痰、抑菌等作用的物质基础[2]。以往文献对枳壳挥发油的研究主要集中在化学成分[3],较少涉及抑菌活性[4-5]。

中药成分复杂多样,生物活性往往是多种成分作用于多靶点的整体结果。植物挥发油的抑菌活性也是由其成分组成决定的[6],而且不一定主要化合物[7],并通过协同或拮抗作用发挥效果[8-9]。

谱效关系是一种将化学特征鉴别与生物活性评价整合为一体的综合性评价模式[10-12],对于成分复杂且有效成分不明确的中药而言,是明确其药效物质基础、评价其质量的重要手段。其中,偏最小二乘回归法集合了多元线性回归、主成分分析和典型相关分析的优点,可较好地揭示各色谱峰与药效指标间的相关性[13-14]；双变量相关分析[15]是一种研究两个变量之间相互关系的统计学方法,以相关系数的大小及方向反映药效指标与色谱峰关系的密切程度及正负关系。

因此,本实验采用GC-MS 法分析枳壳挥发油化学成分,通过偏最小二乘回归法、双变量相关分析筛选并确定其抑菌化合物,从分子化学水平阐明其物质基础,为寻求不良反应较小的天然中药相关活性成分提供基础。

1 材料

1.1 试剂与药物 12 批枳壳经湖南中医药大学中药鉴定教研室刘塔斯教授鉴定为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实,具体信息见表1。氨苄西林[批号A100339-0005,生工生物工程(上海) 股份有限公司]；硫酸庆大霉素碳酸铋(山西云鹏制药有限公司)。乙酸乙酯、DMSO (二甲基亚砜)、无水硫酸钠、氯化钠均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

表1 样品信息

1.2 菌株 金黄色葡萄球菌ATCC26003、大肠杆菌ATCC44138、沙门氏菌ATCC50115、表皮葡萄球菌(广东省微生物菌种保藏中心)。

1.3 培养基 营养琼脂培养基(批号140720,杭州滨河生物试剂有限公司)；营养肉汤培养基(批号130730,杭州天和微生物试剂有限公司)。

1.4 仪器 GC-MS-QP2010 型色谱仪(日本Shimadzu 公司)；JK-G-522B3 型高速万能粉碎机(上海精密科学仪器有限公司)；DZTW 型调温电热套(北京市永光明医疗仪器有限公司)；挥发油提取装置(成都蜀牛科技有限公司)；SW-CJ-2FD 型净化工作台(南京迅达空气技术有限公司)；LDZM-60KCS 型高压蒸汽灭菌锅(上海永安医疗器械厂)；DH-400AB 型电热恒温培养箱(成都致力仪器有限公司)；ZHWY-200D 型恒温振荡器(上海智仁分析仪器制造有限公司)；DEN-1 型麦氏比浊仪(英国格兰特仪器公司)。

2 方法与结果

2.1 炮制品制备 参照2015 年版《中国药典》 进行。

2.2 挥发油提取 将生品和炮制品粉碎后过40 目筛,各取1 kg 粉末,置于10 000 mL 圆底烧瓶中,加入蒸馏水浸泡过夜,安装挥发油提取装置,参考2015 年版《中国药典》 四部通则2204 挥发油测定法提取枳壳挥发油,经无水Na2SO4干燥后封装备用。

2.3 抑菌活性检测

2.3.1 对照品溶液制备 精密称取氨苄西林粉末500 mg,无菌水定容至5 mL,得100 mg/mL 贮备液,精密吸取200 μL,无菌水稀释至100 mL,即得200 μg/mL 相应阳性对照品溶液；精密称取硫酸庆大霉素碳酸铋0.3 g (每0.6 g 含40 mg 庆大霉素),无菌水稀释至100 mL,即得200 μg/mL相应阳性对照品溶液。

2.3.2 菌悬液制备 将实验用菌种接种于营养琼脂平板上,37 ℃下恒温培养24 h 后,挑选特征菌落接种于营养肉汤培养基中,37 ℃摇床培养12 h 后采用麦氏比浊法,无菌生理盐水将其稀释至0.5 麦氏比浊单位,即1.5×108CFU/mL。

2.3.3 抑菌圈测定 采用滤纸片法[16]。取挥发油1 mL,0.22 μm 微孔滤膜过滤。将药敏空白滤纸片置于洁净干燥的培养皿中,干热灭菌后加到挥发油中浸泡过夜,临用前用无菌镊子将纸片置管口干燥0.5 h。取20 mL 熔化后的营养琼脂倒入9 cm 平板,待其凝固后吸取200 μL 菌液,均匀涂布于凝固的营养琼脂平板上,在每个含菌平皿呈正三角放入3 张含上述同种药液的滤纸片,以氨苄西林为革兰氏阳性菌的阳性对照,庆大霉素为革兰氏阴性菌的阳性对照,无菌水为阴性对照,37 ℃下恒温培养24 h 后取出,游标卡尺测量抑菌圈直径,计算抑菌系数[17](样品的抑菌圈直径/阳性对照的抑菌圈直径),结果见表2。

由此可知,生品、炮制品均对革兰氏阳性菌的抑制效果更强,这是因为挥发油是通过破坏细菌的细胞膜而发挥这样[18],而革兰氏阳性菌、阴性菌细胞壁结构明显不同,使前者对挥发油成分的敏感性通常比后者更明显[7,19-20]；但沙门氏菌是个特例,由于它具有不同的细胞靶标,可通过多种形式特异性结合挥发油中不同成分,导致可能比某些革兰氏阳性菌更加敏感[21-22]。

表2 挥发油抑菌圈测定结果（，n=3）

表2 挥发油抑菌圈测定结果（，n=3）

2.4 GC-MS 指纹图谱建立

2.4.1 供试品溶液制备 精密吸取“2.2” 项下挥发油200 μL,乙酸乙酯定容至5 mL,过0.22 μm 微孔滤膜,即得,冷藏备用。

2.4.2 GC-MS 分析 参考文献[5]报道。

2.4.2.1 GC HP-5MS 石英毛细管柱(5% Phenyl Methyl Silox,0.25 μm×0.25 mm×30 m)；进样口温度280 ℃；载气氦气,体积流量1.0 mL/min；分流比10∶1；进样量1 μL；程序升温(柱温60 ℃,保持3 min,2 ℃/min 升至80 ℃,5 ℃/min 升 至120 ℃,2 ℃/min 升至160 ℃,15 ℃/min 升至260 ℃,保持10 min)。

2.4.2.2 MS 电离方式EI；电子轰击能70 eV；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；接口温度260 ℃；质量范围m/z 50～400。

2.4.3 方法学考察 对上述实验条件进行方法学考察,发现仪器精密度、稳定性、重复性良好,回收率RSD 均小于3.0%。

2.5 谱效关系分析

2.5.1 GC-MS 指纹图谱建立 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版” 软件,对16 批样品的GC-MS指纹图谱数据进行分析,以S4 为参照,经过多点校正、自动匹配后生成对照指纹图谱(图1),确定了12 个共有峰。经过质谱计算机数据系统检索(NIST05.LIB、NIST05 s.LIB 质谱数据库) 与CAS 号查询,结合相关文献和各项分析鉴定确定其成分,峰面积归一化法计算各成分相对含有量,结果见表3。

图1 挥发油对照指纹图谱

由此可知,炮制前后共鉴定出12 种主要成分,分别占生品、炮制品挥发油总量的98.67%、97.55%；相对含有量较高的为D-柠檬烯、γ-萜品烯、芳樟醇、大根香叶烯D,在生品、炮制品挥发油中分别占 84.99%、6.57%、2.66%、1.39%,80.94%、7.44%、3.96%、1.95%。炮制前后挥发油总量及组成发生了变化,可能是由于麦麸与药材共同加热时可吸收部分挥发油,使其含有量降低,并改变了各组分间的比例[23]。

2.5.2 抑菌活性谱效分析 采用SPSS 17.0 软件,以抑菌圈直径为变量Y,色谱峰面积为变量X 进行相关分析,建立生品、炮制品共有峰峰面积与其药效学的Pearson 相关系数,见表4。再采用SIMCA 13.0 软件进行偏最小二乘回归法(PLSR) 分析,建立生品、炮制品对试验菌的谱效关系模型,发现生品对沙门氏菌,炮制品对金黄色葡萄球菌的建模效果较好,标准化回归系数图和VIP 图见图2～3。

表3 共有峰成分鉴定及其相对含有量

表4 共有峰峰面积与抑菌圈直径的Pearson 相关系数

在偏最小二乘法中,回归系数绝对值反映色谱峰对抑菌圈直径的贡献程度,其数值越大,贡献越大；回归系数的符号反映与抑菌圈直径的相关性,由于抑菌圈直径与药效呈正相关,故回归系数为正的色谱峰是对挥发油抑菌活性有贡献者。变量重要性值(VIP) 可评价自变量对因变量解释的重要程度[24],当VIP ＞1 时,说明自变量是重要的。

结合双变量相关分析结果可知,生品挥发油对金黄色葡萄球菌的抑制作用主要是由6、7 号色谱峰所代表的γ-萜品烯、4-蒈烯含有量决定,对表皮葡萄球菌的抑制作用主要是由2、6、11、7 号色谱峰所代表的β-蒎烯、γ-萜品烯、大根香叶烯D、4-蒈烯含有量决定,对大肠杆菌的抑制作用主要是由12、4 号色谱峰所代表的棕榈酸甲酯、D-柠檬烯含有量决定,对沙门氏菌的抑制作用主要是由6、7 号色谱峰所代表的γ-萜品烯、4-蒈烯含有量决定；炮制品挥发油对金黄色葡萄球菌的抑制作用主要是由5、8 号色谱峰所代表的β-罗勒烯、芳樟醇含有量决定,对表皮葡萄球菌的抑制作用主要是由7 号色谱峰所代表的4-蒈烯含有量决定,对大肠杆菌的抑制作用主要是由4、1 号色谱峰所代表的D-柠檬烯、α-蒎烯含有量决定,对沙门氏菌的抑制作用主要是由2、9 号色谱峰所代表的β-蒎烯、α-萜品醇含有量决定。

3 讨论

图2 生品PLSR 标准化回归系数和VIP 值

图3 炮制品PLSR 标准化回归系数和VIP 值

文献报道,α-萜品醇、γ-萜品烯是挥发油中的强力抑菌成分[25],其中前者可抑制大肠杆菌、表皮葡萄球菌、白色念珠球菌等微生物的生长[7]；4-蒈烯被证实对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、白色念珠菌均有抑制活性[26]；芳樟醇具有广谱抗细菌、真菌活性[27]；α-蒎烯、2-β-蒎烯、柠檬烯也有较强的抗细菌活性[28],这些成分通过破坏细菌或真菌细胞膜的完整性,从而对上述微生物发挥毒性作用[29]。Guo 等[30]分析国内栽培的几种主要柑橘类品种中挥发油抑菌活性的物质基础,发现β-蒎烯、芳樟醇对多种微生物具有显著作用,α-蒎烯对乙型副伤寒沙门氏菌有一定效果。一些研究证明,柠檬烯具有杀菌、抗氧化等活性[31],但该成分容易氧化,而且难溶于水,导致其活性降低,故在高剂量下可能不会产生高抗菌活性,但如果将其与乳化剂或者其他天然抑菌成分组合时,则可在低剂量下即有显著抑菌活性[32]。Haber 等[33]指出,挥发油主要成分大根香叶烯D 对蜡样芽孢菌、金黄色葡萄球菌[34]、大肠杆菌、铜绿假单胞菌均有抑制作用,而罗勒烯可抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌,尤其是表皮葡萄球菌的生长[35]。另外,棕榈酸甲酯也被证实具有抑菌活性[36]。以上发现均对本实验起到了重要的支撑作用。

本实验先通过GC-MS 法获得枳壳挥发油指纹图谱,滤纸片法得到其对4 种细菌的抑菌效果,然后采用PLSR、双变量相关分析揭示了其谱效关系,发现对枳壳挥发油抑菌活性贡献较大的成分主要为芳樟醇、α-萜品醇、D-柠檬烯、α-蒎烯、β-蒎烯、γ-萜品烯、4-蒈烯、大根香叶烯D、β-罗勒烯和棕榈酸甲酯,并通过协同作用发挥效果。今后,将进一步分离枳壳挥发油药效成分,分析其单体及多种成分通过协同/敌对作用在体外的抑菌活性,以及共有峰之外的色谱峰是否与其抑菌活性相关。

综上所述,本实验初步探讨了枳壳挥发油发挥抑菌作用的主要有效成分,为解决细菌对抗生素的耐药性,寻求不良反应较小的天然中药香港活性成分提供依据,同时也为中药谱效关系分析提供参考。