骨髓间充质干细胞在功能性自组装多肽支架中其生物学行为变化的研究

厦门大学附属第一医院骨科 （福建 厦门 361000）

内容提要：目的：探讨自组装多肽/珊瑚/BMP-2这一材料复合体作为骨组织工程材料的可能性，研究自组装多肽/珊瑚/BMP-2这一材料复合体中的各个成分能否取长补短，为骨折修复策略提供有价值的研究数据。方法：实验于2014年3月～2015年3月在华中科技大学同济医学院骨科中心实验室中完成，将骨髓间充质干细胞（BMSCs）和进行共培养，分为3组进行对照研究。观察组1：RADA16/珊瑚/BMP-2组；观察组2：RADA16/珊瑚组；对照组：珊瑚组。观察复合材料体系（自组装多肽/珊瑚/BMP-2）与BMSCs的细胞相容性，分析自组装多肽/珊瑚/BMP-2这一材料复合体对兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的生物学行为的影响。结果：BMSCs生长发育良好，分布均匀，呈现出良好的态势。培养3d后，3个组别均未明显发现存在死亡细胞。BMSCs和不同系统的细胞相容性良好。结论：复合材料体系（自组装多肽/珊瑚/BMP-2）在体外显示了良好的细胞相容性及生物学活性，良好的超微结构，可能成为骨组织修复工程中的优质材料。

在骨组织工程的生物材料领域中自组装多肽是新的研究热点，其具有许多优点：模拟自然细胞外基质环境、机械强度适中以及高密度同时可设计的活性表位等，在骨组织工程中具有很好的应用前景[1,2]。在本课题的前期研究中，已经验证了珊瑚材料对骨髓间充质干细胞（BMSCs）促进细胞黏附、生长和分化的作用。本研究将骨髓间充质干细胞（BMSCs）和进行共培养，观察自组装多肽/珊瑚/BMP-2这一材料复合体对兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的生物学行为的影响，探讨自组装多肽/珊瑚/BMP-2这一材料复合体作为骨组织工程材料的可能性，为骨折修复策略提供有价值的研究数据。

1.材料与方法

1.1 一般资料

自2014年3月～2015年3月于华中科技大学同济医学院骨科中心实验室。普通级日本大耳白兔1只（华中科技大学同济医学院动物实验中心），5周龄。珊瑚，BMP-2，DMEM/F12培养基，CaCl2溶液，10%蔗糖溶液，PBS缓冲液。分组情况如下：观察组1：RADA16+珊瑚+BMP-2组；观察组2：RADA16+珊瑚组；对照组：珊瑚组。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分离、培养及鉴定。取实验白兔，使用电推刮除白兔取材处毛发，并处死。在无菌条件下于股骨处分离出一段肌肉及筋膜组织，并取出一侧股骨。为防止干扰，将剥脱下的股骨上附着的软组织尽量刮除干净。将股骨两端剪开，暴露髓腔。使用装有10mL混合适量肝素钠的无血清细胞培养基的无菌注射器，使用此混合液将股骨内的骨髓冲入培养皿。无菌操作下，将反复吹打均匀骨髓并离心。离心后可见分为明显的三层。倾斜离心管，将单核细胞层吸出并放置于另一个离心管当中，并用无血清细胞培养基洗洚2次（5min，l000r/min），同时弃掉上清液加入培养基并反复吹打形成单细胞悬液。

1.2.2 复合材料体系（自组装多肽/珊瑚/BMP-2）的准备。超声震荡RADA16溶液30min，将60μL的多肽溶液平均放置于24孔的Transwell的insert小室中（insert小室直径6.5mm），使其形成大约1mm厚度（观察组1：RADA16/珊瑚/BMP-2组；观察组2：RADA16/珊瑚组；对照组：珊瑚组）。加入等体积的DMEM/F12细胞培养基，从而促进自组装（注意缓慢加入）。将完成的insert小室放入37˚C温箱孵育30min，之后将insert小室取出。观察到自组装多肽形成水凝胶后，用DMEM/F12细胞培养基轻轻漂洗insert小室内的水凝胶。12h漂洗3次，在最后1次漂洗后，将insert小室放置过夜。

1.2.3 复合材料体系（自组装多肽/珊瑚/BMP-2）与BMSCs的细胞相容性。在37.0˚C，5% CO2浓度和饱和湿度的培养箱中进行培养，每3d更换培养基，当细胞铺满瓶底80%～90%时使用0.25%胰蛋白酶消化传代。取第3代细胞做流式鉴定。将BMSCs培养至第三代，选取生长状态良好的部分，使用0.25%胰蛋白酶将其消化。收集消化后的细胞，制备BMSCs单细胞悬液。将BMSCs以2×105个/mL浓度接种于复合材料体系（观察组1：RADA16/珊瑚/BMP-2组；观察组2：RADA16/珊瑚组；对照组：珊瑚组）表面。接种了BMSCs的复合材料中，再加入DMEM/F12细胞培养基。将其放入恒温37˚C、CO2浓度为5%的细胞培养箱中继续培养。每隔2d换液，分别混合培养至3d，7d，14d后，取出，PBS漂洗2遍，加入PI&Ca-am染料染色，37˚C孵育30min后，使用荧光及激光显微镜观察细胞存活情况。

1.3 统计学分析

2.结果

2.1 BMSCs形态学观察及形态学鉴定（骨髓间充质干细胞）

BMSCs显示的细胞形态见图1。BMSCs生长发育良好，分布均匀，呈现出良好的态势。

图1.BMSCs显示的细胞形态

图2.培养3d后，BMSCs和不同系统的细胞相容性（2a.观察组1：RADA16+珊瑚+BMP-2组；2b.观察组2：RADA16+珊瑚组；2c.对照组：珊瑚组。）

2.2 复合材料体系（自组装多肽/珊瑚/BMP-2）对BMSCs的毒性研究

图2显示，培养3d后，BMSCs和不同系统的细胞相容性良好。生存细胞会发出绿色的荧光，死亡细胞会发出红色的荧光。3个组别均未明显发现存在死亡细胞。

珊瑚在材料体系中扮演了刚性的“钢筋混凝土”样的结构地位，为整个材料体系提供了足够的机械强度；同时，其主要成分也为构建成骨细胞微环境提供了重要保障。自组装多肽RADA16在DMEM/F12细胞培养基触发下形成水凝胶，性质柔软，含水量高[4]。扫描电子显微镜证实其形成了纳米级别的纤维与层状结构。RADA16凝胶支架细胞相容性，细胞学毒性，促进BMSCs的黏附和向成骨细胞分化这几个方面都显示出了优异的良性结果。复合材料体系全部由氨基酸，天然材料和成分组成，生物相容性好，无明显毒性，易代谢，无明显排异反应；珊瑚的孔隙结构与自组装多肽形成的三维结构与骨组织结构相近；珊瑚孔隙率高，自组装多肽凝胶含水量高，达95%以上，营养物质易于运输，代谢废物易于排出。

3.讨论

适宜的种子细胞一直是组织工程研究者关注的重点。干细胞在给定的条件下可向不同类型的细胞加以分化，同时，干细胞的合成与代谢能力也比成熟成体细胞更为成熟与优秀。其在组织工程的种子细胞中具有广阔的应用前景。就骨组织工程本身来说，具有分化潜能的干细胞（比如骨髓间充质干细胞BMSCs）可能是治疗骨折变最理想的种子细胞。

优异的生物学功能，良好的超微结构，这两点一直是组织工程研究者在寻找组织工程材料时所要求的基本要素。自组装多肽纳米纤维凝胶支架具有良好的三维生物学纳米结构、生物学活性和生物-材料界面相容性，目前已成为骨组织工程中颇具前景的生物材料。珊瑚作为自然生物材料，其基本理化性质、孔隙率等与骨组织有着众多相似性，在口腔科、颌面部整形方面已经充当着重要的应用角色[3]。而骨形态发生蛋白则可促进BMSCs向成骨细胞分化、增殖[4]。本研究中，将兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）与珊瑚、RADA16凝胶、BMP-2所形成复合材料体系进行共培养，研究复合材料体系对兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）生物学行为的影响，期待能为复合材料体系（自组装多肽/珊瑚/BMP-2）和骨髓间充质干细胞（BMSCs）联合移植治疗骨折提供可靠的实验依据[5]。

本实验结果表明：这种复合材料体系在体外显示了良好的细胞相容性及生物学活性，但复合材料体系和BMSCs一起移植到供体后能否确实产生修复的预期结果还需进一步证实[3]。

将查阅的文献和本次研究综合来看，本次研究中的复合材料体系（自组装多肽/珊瑚/BMP-2）与其他骨组织工程传统材料相比，具有以下优点：①全部由氨基酸，天然材料和成分组成，生物相容性好，无明显毒性，易代谢，无明显排异反应；②珊瑚的孔隙结构与自组装多肽形成的三维结构与骨组织结构相近；③珊瑚孔隙率高，自组装多肽凝胶含水量高，达95%以上，营养物质易于运输，代谢废物易于排出。综上所述，复合材料体系（自组装多肽/珊瑚/BMP-2）在不久的将来将为骨组织修复工程贡献新的力量。