基于网络药理学和分子对接探讨槲皮素治疗冠心病的分子机制

徐江林，林 谦，刘 静，万 洁，崔晓云，纪 翔，毛天诗，张 卓，逯金金

冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)简称冠心病，是由于冠状动脉狭窄导致心肌细胞缺血、缺氧或坏死而引起的心脏病[1]。《中国心血管健康与疾病报告2019概要》指出，我国有约1 100万例心力衰竭病人，患病率、死亡率均呈上升趋势[2]。冠心病严重影响病人生活质量，给社会、经济带来巨大负担，且长期单纯使用西药治疗存在一定的副作用。近年来，新药研发领域方面，天然药物化学成分受到学者重视，天然产物是治疗疾病和研发药物的重要化合物来源[3]。槲皮素(Quercetin)又称为槲皮黄素、栎精，是一种天然黄酮类化合物，广泛存在于自然界中，可从植物花、叶、果实中提取得到，且存在于多种中药中，如黄芪、三七等。现代药理研究表明，槲皮素通过抗氧化、抗炎等作用减轻冠心病心脏损伤[4]。目前关于槲皮素治疗冠心病的作用机制尚不明确。网络药理学是一种新型的药物研究方法，可全面、系统地分析药物与疾病的关系，为研究药物内部复杂的分子机制提供有力的工具[5]。本研究基于网络药理学，探讨槲皮素治疗冠心病的分子机制，为今后基础研究提供新思路。

1 资料与方法

1.1 槲皮素潜在靶点的获取 通过中药系统药理学数据库和分析平台[Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)][6]、Pharm Mapper (http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)数据库[7]和Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)数据库[8]检索及预测，通过UniProt数据库(http：//www.uniprot.org/)校正靶点名称为专业学术名称，由此获得槲皮素的潜在靶点。

1.2 冠心病的相关靶点收集 以“coronaryheart disease”为关键词，分别检索DisGeNET(http://www.disgenet.org/)[9]和GeneCards(https://www.genecards.org/)[10]数据库，获取冠心病相关靶点。

1.3 槲皮素治疗冠心病的共同靶点 通过在线软件作图工具InteractiVenn构建Venn图，得到槲皮素-冠心病的共同靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络构建 将槲皮素-冠心病共同靶点输入STRING数据库(https://string-db.org/)[11]，以高置信度(high confidence>0.7)进行筛选，隐藏网络中无关联节点，将结果文件保存为tsv格式，导入Cytoscape 3.7.2软件，使用cytoHubba插件对PPI网络进行分析，筛选槲皮素治疗冠心病的关键靶点。

1.5 基因本体(gene ontology，GO)功能与京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 将槲皮素-冠心病的共同靶点输入Metascape数据库(http://metascape.org/gp/index.html)[12]，进行GO功能与KEGG通路富集分析。GO功能分析得到生物学过程、细胞组分、分子功能和生物功能，用于描述基因靶点功能。KEGG通路富集分析得到槲皮素-冠心病共同靶点所富集的信号通路。

1.6 网络构建 使用Cytoscape 3.7.2软件，构建“槲皮素-共同靶点-冠心病”网络和“槲皮素-关键靶点-主要通路-冠心病网络”，槲皮素、冠心病和相关靶点以“节点”显示，节点之间相互作用以“边”显示。使用Network Analyzer插件计算“槲皮素-关键靶点-主要通路-冠心病网络”中节点自由度(Degree)。

1.7 分子对接 将得到的核心成分与关键靶点进行分子对接，得到对接亲和力以反映分子间的结合稳固性。从PDB数据库下载蛋白质分子结构，TCMSP下载化合物的结构，使用PyMol 2.4.0和Auto Dock Tools软件对蛋白质、化合物进行处理，Auto Dock Vina软件进行分子对接，PyMol 2.4.0进行可视化[13-14]。

2 结 果

2.1 槲皮素的潜在靶点 通过TCMSP、PharmMapper和Swiss Target Prediction数据库检索及预测，删除重复数据后共得到459个槲皮素的潜在靶点。

2.2 冠心病的相关靶点 以“coronary heart disease”为关键词检索GeneCards和DisGeNET数据库，收集靶点并去除重复数据后共得到2366个冠心病的相关靶点。

2.3 槲皮素-冠心病的共同靶点 将459个槲皮素潜在靶点和2 366个冠心病相关靶点输入在线软件作图工具InteractiVenn，绘制Venn图，取交集后共得到槲皮素-冠心病共同靶点233个。详见图1。

图1 槲皮素-冠心病共同靶点的Venn图

2.4 槲皮素-共同靶点-冠心病网络 将槲皮素、冠心病及233个共同靶点输入Cytoscape 3.7.2软件，得到槲皮素-共同靶点-冠心病网络，共235个节点和466条边。详见图2。

图2 槲皮素-共同靶点-冠心病网络图(绿色节点代表槲皮素，紫色节点代表冠心病，红色节点代表共同靶点)

2.5 PPI网络及槲皮素治疗冠心病的关键靶点 使用cytoHubba插件根据Degree对PPI网络进行分析，得到5个槲皮素治疗冠心病的关键靶点，详见表1。将槲皮素-冠心病共同靶点输入STRING数据库，通过高置信度(>0.7)筛选得到PPI网络，网络包含224个节点和1 915条边，详见图3。

表1 槲皮素治疗冠心病的关键靶点信息表

图3 槲皮素治疗冠心病的关键靶点

2.6 GO功能和KEGG通路富集分析 GO功能富集分析结果显示，生物学过程主要集中在创伤反应(responsetowounding)、脂多糖反应(responseto lipopolysaccharide)、凋亡信号通路(apoptotic signaling pathway)、有毒物质反应(response to toxic substance)、细胞运动正调节(positive regulation of cell motility)；细胞组分主要集中在囊泡腔(vesicle lumen)、膜筏(membrane raft)、细胞外基质(extracellular matrix)、细胞顶端(apical part of cell)、细胞质核周区域(perinuclear region of cytoplasm)；分子功能主要集中在蛋白激酶活性(protein kinase activity)、内肽酶活性(endopeptidase activity)、辅因子结合(cofactorbinding)、激酶结合(kinase binding)、蛋白质同源二聚化活性(protein homodimerization activity)。KEGG通路富集分析结果显示，通路主要富集在癌症(pathways in cancer)、糖尿病并发症晚期糖基化终产物(AGE)及其受体(RAGE)信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、低氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路(HIF-1 signaling pathway)、铂耐药(Platinum drug resistance)。详见图4。

图4 GO功能和KEGG通路富集分析结果(排名前20)

2.7 槲皮素-关键靶点-主要通路-冠心病网络 网络中共17个节点和44条边，绿色节点代表槲皮素，紫色节点代表关键靶点，红色节点代表主要通路，黄色节点代表冠心病。节点的形状和字体大小、颜色深度与Degree呈正相关。详见图5。

图5 槲皮素-关键靶点-主要通路-冠心病网络图

2.8 分子对接分析 将槲皮素与5个关键靶点进行分子对接，得到平均对接亲和力为-7.9 kcal/mol，详见表2。对接亲和力越小，提示配体与受体蛋白结合越稳定，表明槲皮素与关键靶点具有较强的结合力。槲皮素与AKT1分子对接结果最佳，对接模式见图6。左侧图中黄色分子为槲皮素，显示槲皮素可与AKT1中相互作用的氨基酸残基形成界面的活性口袋分子匹配，右侧图片显示对接部分的细节。

表2 分子对接结果

图6 槲皮素与AKT1分子对接模式图

3 讨 论

冠心病归属于中医学“胸痹”“真心痛”等范畴，基本病机以气虚为本、血瘀为标。槲皮素是典型的天然黄酮类化合物，常用益气活血中药如黄芪、三七等治疗，有研究表明，槲皮素通过降低氧化应激，抑制炎症级联反应，抑制体内细胞凋亡，保护心肌免受缺血再灌注损伤[15]。Dong等[16]发现，槲皮素可能通过下调HMGB1-TLR4-NF-κB信号通路，抑制细胞炎性因子产生，改善冠状动脉结扎大鼠及H9C2细胞的缺血再灌注损伤，但深层机制需进一步探讨。因此，本研究运用网络药理学方法探讨槲皮素治疗冠心病的分子机制。

本研究结果发现，槲皮素可能通过233个靶点作用于冠心病。通过对PPI网络进一步分析，得到槲皮素治疗冠心病的5个关键靶点，分别是AKT1、TP53、MAPK1、IL-6、VEGFA。AKT是调节多种细胞功能的复杂信号通路中心，分为3种亚型AKT1、AKT2和AKT3。其中，AKT1在心脑组织中表达最丰富，敲除AKT1基因导致动脉粥样硬化小鼠模型的血管平滑肌细胞增殖、迁移减少，氧化应激诱导的细胞凋亡增加，增加斑块易损性，导致严重动脉粥样硬化和闭塞性冠状动脉疾病[17]。AKT1通过AKT1-eNOS信号轴调控一氧化氮(NO)产生，减轻缺血再灌注对心肌细胞损伤[18]。TP53是一种抑癌基因蛋白，具有抑癌和调节细胞凋亡作用。TP53基因突变可抑制细胞凋亡导致动脉粥样硬化，且与冠心病发生密切相关[19-20]。MAPK1基因又称为细胞外信号调节激酶2(extracellular signal-regulated kinases，ERK2)基因，参与ERK1/2信号通路及增殖、分化、转录调节等多种细胞进程。相关研究表明，MAPK-1/HIF1/HO-1基因多态性与围绝经期冠心病显著相关[21-22]。Chen等[23]研究发现，抑制ERK1/2信号通路和激活肝X受体(liver X receptor)可能通过保护动脉完整性，防止巨噬细胞/泡沫细胞形成及增强胆固醇逆向转运等多种机制减轻动脉粥样硬化。IL-6是促炎性细胞因子的一种，参与各种炎症和免疫反应，Bernberg等[24]研究发现，应激通过增加IL-6释放进而促进动脉粥样硬化发展。VEGFA是一种血管内皮生长因子，主要参与调控血管生成，Zou等[25]研究发现，VEGFA通过增加活性氧的生成及增强内质网应激介导的自噬，促进急性心肌梗死后血管生成，从而改善缺血性心肌病。

KEGG通路分析主要富集在癌症、糖尿病并发症晚期AGE及其受体(RAGE)信号通路、MAPK信号通路、HIF-1信号通路、铂耐药。持续性高血糖形成蛋白内交联而产生AGEs，AGEs直接参与动脉粥样硬化和细胞内信号传导的调节，对内皮细胞反应、血管平滑肌细胞功能和血小板活性产生有害作用，增强炎症和氧化应激，在冠心病的病理生理中发挥重要作用[26-28]。MAPK信号通路包括4个级联反应：p38-MAPKs、Jun氨基末端激酶(JNK)、细胞外信号相关激酶1/2(ERK1/2)和细胞外信号调节激酶5(ERK5)，调控细胞生长、炎症、凋亡和应激反应等多种过程[29]。相关研究发现，p38-MAPK的激活通过磷酸化活化核因子-κB(NF-κB)，促使血管内皮细胞过度表达促炎细胞因子，加重炎性损伤，促进动脉粥样硬化发展[30]。HIF-1广泛参与多种细胞信号通路，是介导缺氧信号传导的中枢，其中HIF-1α主要调节氧气稳态，在缺氧性损伤中发挥重要作用[31]。冠心病病人HIF-1α蛋白表达增加，与冠心病的发生密切相关[32]。Liu等[33]研究发现，过表达miR138靶向HIF1-α，可抑制心肌缺血再灌注损伤诱导的线粒体凋亡，从而减小心肌缺血再灌注损伤导致的心肌梗死范围。癌症通路包括MAPK信号通路、VEGF信号通路、p53信号通路、PI3k-AKT信号通路等。持续激活JNK和ERK1/2通路可增加癌细胞对铂类药物的耐药性[34]。

GO分析中，生物学过程主要与创伤反应、脂多糖反应、凋亡信号通路、有毒物质反应、细胞运动正调节相关，与上述通路介导的生物学过程相符。分子对接结果显示，所有对接配对具有良好的对接亲和力，从分子角度进一步验证了槲皮素对冠心病靶点的调节作用，同时证明网络药理学的可靠性。

综上所述，本研究通过网络药理方法探讨槲皮素治疗冠心病的潜在机制，确定槲皮素治疗冠心病的关键靶点、主要生物学过程及主要通路，为基础研究提供方向。