同型半胱氨酸对肾小管上皮细胞IRE1/caspase12/caspase3通路的影响

龙艳君 袁 静 董 蓉

贵州省人民医院肾内科 贵州 贵阳 550002

血清或血浆同型半胱氨酸(Hcy)浓度升高,称为高同型半胱氨酸血症(HHcy)[1]。一项基于60754例来自中国19个省市36个研究报道的荟萃分析结果报道我国HHcy整体患病率为27.5%,近年发病率呈增加趋势[2]。我们既往的研究发现,HHcy可以通过内质网应激途径加重小鼠的急性肾损伤[1]。因此,本研究将在细胞水平上,探讨Hcy对肾小管上皮细胞p-IRE1/caspase12/caspase3通路的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞和分组 大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)随机分为同型半胱氨酸组(Hcy组)和对照组(Con组),分别用含终浓度为1mmol/L和0mmol/L的Hcy细胞培养液培养24 h,以Western blotting检测p-IRE1、cleaved-caspase12、cleaved-caspase3的表达。

1.2 Western blotting检 测 p-IRE1、cleaved-caspase12、cleavedcaspase3的表达 收集细胞,提取总蛋白,测定蛋白浓度。加入等体积上样缓冲液,96℃以上金属浴10min。每上样孔加100ug总蛋白行SDS-PAGE。湿转法电转移至PVDF膜。在5%BSA中,室温封闭1小时。分别加入稀释的待测一抗,4℃摇床过夜。而后加辣过氧化物酶标记的山羊抗兔/小鼠IgG室温孵育1小时。最后,将膜置于发光液中2min,在暗室中曝光、显影、定影、洗片,并对蛋白质条带进行灰度分析。

1.3 统计学处理 实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示,用统计软件SPSS25.0完成统计分析。两组数据之间的比较采用独立样本t检验。p＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

与对照组相比,NRK-52E细胞经过Hcy处理后p-IRE1、cleavedcaspase12、cleaved-caspase3的表达明显增加(p＜0.05)(见下图)。

3 讨论

同型半胱氨酸(Hcy)是蛋氨酸代谢过程中产生的一种含硫氨基酸。Hcy稳态在各种细胞代谢途径中起重要作用,Hcy的异常升高可导致细胞死亡[3,4]。凋亡是细胞死亡的主要形式之一。我们既往的研究发现,同型半胱氨酸升高可促进肾小管上皮细胞的凋亡[1]。细胞凋亡可通过内质网应激途径引起。在内质网应激时,内质网膜上的肌醇依赖酶(IRE1)与免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)解离后可发生自身磷酸化而激活,磷酸化的肌醇依赖酶(p-IRE1)可通过激活caspase12引起caspase3的活化,从而导致细胞的凋亡。本研究结果显示,Hcy处理后的NRK-52E细胞p-IRE1、cleavedcaspase12和cleaved-caspase3的表达增加,提示Hcy引起了肾小管上皮细胞IRE1/caspase12/caspase3通路的活化,这可能是其促进肾小管上皮细胞凋亡的机制之一。

Hcy促进了 NRK-52E细胞p-IRE1、cleaved-caspase12、cleavedcaspase3的表达

注:*p＜0.05 vs对照组