RNAⅢ抑制肽对不同生长时相金黄色葡萄球菌毒力因子表达的影响

2021-01-21 09:46薛小燕
中国医药导报 2020年36期
关键词:生物膜对数毒力

周 颖 侯 征 薛小燕 魏 明 李 汾 姚 佳 张 晔 汪 洋

1.西安医学院药理学教研室,陕西西安 710021;2.空军军医大学药理学教研室,陕西西安 710032;3.西安医学院分子病毒与病毒免疫学实验室,陕西西安 710021

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的群体感应系统-附属基因调节(agr)系统,调控多种毒力因子表达[1-3],其中最重要的一类毒力因子是葡萄球菌溶素[4-6]。MRSA 还能够表达一些黏附蛋白,促进细菌生物膜的形成。这些毒力因子在MRSA 侵袭性感染过程中发挥重要作用[7-8]。RNAⅢ抑制肽(RIP)是agr 系统抑制剂。本研究设计合成了新的RIP 衍生物RIP1183,检测其对MRSA 的生长和生物膜形成的影响,以及在不同时相对重要毒力因子表达的影响,探讨RIP1183 抗菌、抗生物膜的作用机制。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

ELx800 酶标仪(美国Bio-tek 公司);AL204 电子天平(梅特勒-托利多);ZHWY-200D 恒温培养振荡器(上海智诚分析仪器制造有限公司);MX3005P1 实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)仪(美国安捷伦)。微量RNA 提取试剂盒RNeasy Mini Kit(QIAGEN),细菌RNA 提取试剂盒RNAprep pure Bacteria Kit,反转录试剂盒PrimeScript Kit,Premix Taq RT-PCR 系统(TaKaRa)。异硫氰酸荧光素(FITC)、葡萄糖均购自Sigma 公司;胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基购自北京陆桥技术有限责任公司。

1.2 菌株和药品

MRSA(USA300)由美国国立卫生研究院(NIH)的Michael Otto 教授友情惠赠。RIP1183 由本课题组设计,委托空军军医大学生物制药教研室合成,白色疏松粉末,批号:20141001,含量:99.41%,保存条件:-20℃低温保存。

1.3 细菌培养

按照1∶100 的比例接种MRSA(USA300)至5 mL的培养基中,37℃振荡培养14 h,将过夜培养的细菌分别转接至10 mL TSB 培养基 (含0.5%的葡萄糖),将细菌浓度调整至1×108CFU/mL。RIP 组加入RIP1183使其终浓度为50 μg/mL。对照组加入无菌磷酸盐缓冲液。37℃振荡培养,每隔2 h 测定1 次吸光度(OD)630值,监测12 h 内细菌生长情况,实验重复3 次。

收集菌体,细菌培养操作同上,每隔2 h 吸取100 μL 菌液,12 000 r/min,4℃,离心10 min,弃去上清,收集沉淀(细菌),保存至-80℃冰箱中。

1.4 细菌生物膜

细菌过夜培养,用含有0.5%葡萄糖的TSB 培养液将菌液稀释至1×106CFU/mL,接种于48 孔培养板中。RIP 组加入RIP1183,使药物终浓度为50 μg/mL,对照组加入无菌磷酸盐缓冲液。37℃湿盒中孵育48 h后,弃上清,无菌磷酸盐洗掉浮游菌和杂质。然后用FITC(0.1 mg/mL)标记贴壁细菌,无菌磷酸盐清洗3 次,避光4℃保存,荧光显微镜(Olympus,CKX41)观察贴壁细菌并拍照。使用Image J 软件定量分析荧光强度。

1.5 qRT-PCR

为了探讨金黄色葡萄球菌不同生长时相,agr 系统的激活情况,以及RIP1183 对细菌葡萄球菌溶素和生物膜形成的影响,分别检测细菌迟缓期(2 h)、对数期(6 h)和稳定期(10 h)16S rRNA、RNAⅢ、人类白细胞抗原(HLA)、icaA 和fnbA 基因的表达水平。

收集的细菌,按照微量RNA 提取试剂盒RNeasy Mini Kit 说明书,提取细菌总RNA。将RNA 溶于30 μL的DEPC 水,然后用反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit 获得cDNA。qRT-PCR 反应:反应体系20 μL,包括cDNA 2 μL,2×SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ10 μL,上游引物(10 μm)1 μL,下游引物(10 μm)1 μL,无菌ddH2O 6 μL。反应条件:segment 1:95℃、5 min;segment 2:95℃、10 s,55℃、30 s,40 个循环;segment 3:95℃、15 s,55℃、60 s,95℃、15 s;每个反应重复3 次。用2-ΔΔCT法计算分析各组基因相对于内参基因16S rRNA的表达量。用于检测基因表达水平的引物序列,见表1。

表1 用于检测基因表达水平的引物序列

1.6 统计学方法

采用GraphPad Prism Version 5.0 统计软件对所得数据进行统计学分析,计量资料用均数±标准差()表示,采用独立样本t 检验。以P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RIP1183 对MRSA(USA300)生长曲线的影响

MRSA(USA300)培养在含葡萄糖的TSB 培养基中,2 h 后由迟缓期进入对数期,8 h 后进入稳定期;RIP 组加入RIP1183(50 μg/mL),MRSA(USA300)同样是在2 h 进入对数期,8 h 后进入稳定期。与对照组比较,RIP1183 不影响细菌生长,差异无统计学意义(P >0.05)。见图1。

图1 RIP1183 对MRSA(USA300)生长曲线的影响

2.2 RIP1183 对细菌生物膜形成的影响

与对照组比较,RIP 组细菌生物膜形成显著减少(P <0.01)。见图2。

2.3 不同时相RIP1183 对RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA基因表达水平的影响

迟缓期(2 h),两组RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 总体表达水平都较低;对数期(6 h),RNAⅢ和HLA 表达水平快速升高;稳定期(10 h),RNAⅢ和HLA 表达水平下降,但是生物膜形成的黏附相关基因(icaA 和fnbA)的表达水平升高。

迟缓期(2 h),与对照组比较,RIP 组RNAⅢ表达明显降低(P <0.05)。对数期(6 h),与对照组比较,RIP 组RNAⅢ、HLA 表达显著降低(P <0.01);稳定期(10 h),与对照组比较,RIP 组icaA、fnbA 和RNAⅢ表达显著降低(P <0.05 或P <0.01)。见表2。

图2 RIP1183 对细菌生物膜形成的影响

表2 不同时相RIP1183 对RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 基因表达水平的影响(,n=6)

表2 不同时相RIP1183 对RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 基因表达水平的影响(,n=6)

注:与对照组同期比较,*P <0.05,**P <0.01;HLA:人类白细胞抗原;RIP:RNAⅢ抑制肽

3 讨论

agr 群体感应系统是金黄色葡萄球菌的重要调控系统,参与调节细菌多种生理活动,对于维持金黄色葡萄球菌生物膜结构和细菌的致病性也是必不可少的[9-10]。RNAⅢ是agr 系统的效应分子,agr 系统激活后,RNAⅢ表达水平升高,RNAⅢ通过与靶基因5’非翻译区(5’UTR)反义碱基配对,形成RNA 双链体,从而进一步调控一系列靶基因的表达[11-12]。RNAⅢ调控多种毒力因子表达包括葡萄球菌溶素和细菌生物膜形成相关蛋白的表达。其中最重要的1 种葡萄球菌溶素是α-溶血素,由HLA 基因编码,它可以破坏宿主多种细胞的细胞膜,改变细胞渗透压,使宿主细胞溶解[4,13-14]。动物实验[4-5]表明,敲除金黄色葡萄球菌HLA基因后,显著降低了其对感染动物的致病性。纤连蛋白结合蛋白FnbA 是由fnbA 基因编码的1 种多阈结构的蛋白质,它能够吸引并黏附宿主的纤维蛋白原,介导金黄色葡萄球菌黏附于生物体表面,并使细菌逃离免疫系统的识别,是生物膜形成的黏附阶段的重要调控蛋白[15-17]。icaA 基因编码的蛋白是1 种普遍存在于金黄色葡萄球菌中的跨膜蛋白,具有N-乙酰葡萄糖氨基转移酶活性,与细菌生物膜的形成有直接关系,也是生物膜形成的必要因素[15]。

据文献[18]报道,在培养基中补充葡萄糖,可以促进细菌生物膜的形成,因此本研究采用含有葡萄糖的TSB 培养基培养MRSA(USA300),发现RIP1183 不影响MRSA(USA300)的生长,结果与文献报道的群体抑制剂不影响细菌生长的结论相一致[19]。但是体外生物膜形成实验结果显示,RIP1183 可以显著抑制MRSA(USA300)生物膜的形成。为了探讨金黄色葡萄球菌不同生长时相agr 系统的激活情况,以及RIP1183对葡萄球菌溶素和生物膜形成的影响,分别在细菌迟缓期(2 h)、对数期(6 h)和稳定期(10 h),检测了RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 基因的转录水平。结果显示,迟缓期(2 h)是细菌转接后对新环境的短暂适应过程,4 种基因RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 总体表达水平都较低;进入对数期(6 h)后,细菌快速增殖,RNAⅢ表达水平快速升高,显示agr 系统被激活,HLA表达也快速增高;进入稳定期(10 h)后,HLA 表达下降,但是与生物膜形成的黏附相关基因(icaA 和fnbA)的表达水平升高。MRSA 通过agr 群体感应系统,在不同时相调控不同的毒力因子的表达,以适应不同生长环境。对数期,释放大量葡萄球菌溶素,增加细菌的毒力和致病性;到了稳定期,黏附相关蛋白表达水平增高,促进细菌生物膜的形成,有利于细菌对抗外界极端环境(如营养缺乏、低pH、高渗透压或抗生素等),这是细菌非常重要的环境适应机制[20-21]。

更重要的是,在3 个时相,RIP1183 均能显著抑制RNAⅢ表达,同时显著降低对数期HLA 的表达及稳定期生物膜黏附相关基因(icaA 和fnbA)的表达水平。本研究结果提示,群体抑制剂RIP1183 能通过干扰细菌agr 系统,影响不同时相,不同基因的表达,从而破坏细菌对环境适应机制,可能是其抗MRSA 活性的重要机制之一。另外,群体感应系统抑制剂不影响细菌的生长,不会或几乎不会给细菌造成选择性生存压力,引起细菌耐药的可能性比较小[22]。因此,抑制群体感应系统可能成为治疗MRSA 生物膜相关感染性疾病的新策略。

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