基因芯片技术应用于颈项透明层增厚病例中的价值研究

丁小瑞 刘爱菊 张 玮 张俊绘

1.内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特 010000；2.内蒙古自治区妇幼保健院妇产科，内蒙古呼和浩特 010000

截止至2012 年调查显示，中国的新生婴儿出生缺陷为5.6%[1]，每年有约3.6 万例新生儿染色体异常[2-3]。现实生活中大多流产、死胎及出生缺陷的罪魁祸首就是染色体异常[4]。随着超声技术的发展，产前超声检查成为产前诊断必不可少的工具，我国把区别于结构畸形的非正常声像异常称为超声软指标异常[5]，颈项透明层（NT）就是其中一项。NT 测量是妊娠早期筛查胎儿染色体异常的金标准[6]，NT 增厚与胎儿染色体异常呈正相关[7]。因此，NT 增厚作为产前诊断有创性筛查的指导依据。核型分析作为曾经产前诊断的金标准，在检测NT 增厚病例中，部分染色体核型正常但最终胎儿出现异常，研究发现，是基因组发生了细小的不均衡变异，最多见的是微缺失和微重复[8]，此类型是传统染色体技术无法检测的。荧光原位杂交技术（FISH）、荧光定量（PCR）、染色体微阵列分析（CMA）等新兴技术的出现，使染色体研究领域有了更进一步的提升。CMA 是一项新的基因芯片技术[9-11]，覆盖全基因组进行扫描，高分辨率能够发现极小的基因拷贝数变异。因此，这种基因技术，被用来解决上述基因组拷贝数变异（CNVs）即染色体片段的重复或缺失的疑难问题。本研究通过对NT 增厚病例行染色体核型分析及CMA检测，对比两者对异常染色体的检出率，旨在探讨CMA 在胎儿NT 增厚中的临床价值，以及CNVs 在不同条件下检出的差异性，以便更好地进行产前诊断及咨询。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2017 年12 月—2019 年12 月因超声提示“胎儿NT 增厚”于内蒙古自治区妇幼保健院产前诊断中心同时行核型分析及CMA 芯片检测的185 例单胎妊娠孕妇。孕妇年龄18～40 岁，平均（30.28±4.42）岁。研究对象纳入标准：①单胎；②参照英国胎儿医学基金会（FMF）的测量标准，孕11～13+6周测量NT 值，NT≥3.0 mm；③孕妇知情并签署知情同意书加入研究。

1.2 研究方法

1.2.1 超声检查及诊断标准 使用EPIQ 7 超声波仪，检查者严格按照英国FMF 的NT 质控标准进行操作。检查孕龄11～13+6周，每个对象重复测量3 次，取最大NT 值纳入研究。目前，对于NT 截断值存在争议，国际上多采用NT 厚度超过第95百分位数为NT 增厚，但目前大部分研究者仍在使用NT≥3.0 mm 为NT 增厚；2.5 mm≤NT＜3.0 mm 为NT 临界增厚[12]，此次实验选取标准为NT≥3.0 mm。

1.2.2 标本采集 在腹部B 超引导下分别行绒毛穿刺（孕11～13+6周）或羊膜腔穿刺术（孕16～24 周）抽取绒毛少许或羊水30 mL 进行细胞培养行核型分析及CMA 芯片检测。

1.2.3 实验方法 CMA：采集绒毛或1 mL 羊水进行细胞沉淀，通过基因组DNA 提取试剂盒（Qiagen，德国），提取全血基因组DNA，通过美国Affymetrix 公司的Cytoscan 750K Array 芯片进行DNA 的分析。

1.3 统计学方法

采用统计学软件SPSS 22.0 处理数据，计数资料组间比较采用χ2检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 染色体结果异常的比较

染色体核型分析结果：总计185 例NT 增厚病例，染色体核型异常的39 例，染色体异常的发生率为21.08%，其中34 例为21 三体；3 例为18 三体；1 例：46，XN，del（18）（P11）；1 例：46，XN，t（15；17）（q15；q25）[4]/46，XN[122]。CMA 结果：共计185 例NT 增厚病例，染色体异常的59 例，染色体异常的发生率为31.89%，其中40 例为染色体数目异常（35 例为21 三体，3 例为18 三体，1 例为14UPD，1 例为47，XXX）；19 例为染色体结构异常。见表1。

2.2 核型分析异常与CMA 结果比较

核型分析共检出39 例染色体异常，包括21 三体34 例，18 三体3 例，嵌合体2 例：①46，XN，t（15；17）（q15；q25）[4]/46，XN[122] 1 例，CMA 检测46，XN，后续检测其父亲染色体出现重合片段，证明染色体正常。②46XN[5]/47，XN+21，CMA 检测结果为21 三体综合征。1 例：46，XN，del （18）（P11），CMA 检测结果18p11.32p11.2 缺失14.94 Mb，P。由此可以看出，CMA可以检出核型分析中的非整倍染色体异常及对核型结果中未知额外标记染色体（sSMC）的内容和来源得出更明确的信息，但CMA 无法识别平衡重排（易位/倒位/插入）。见表2。

2.3 核型分析正常CMA 检测结果

对于核型分析正常病例CMA 检测结果：微缺失/微重复检出较染色体核型分析额外提高10.81%（20/185），致病性CNVs 的检出率提高7.03%（13/185），CMA在微缺失/微重复方面要明显优于核型分析。见表3。

2.4 统计学分析结果

单独NT 异常与NT 异常联合彩超其他结构异常的病例，致病性CNVs 的检出率分别是29.38%（47/160）和48.0%（12/25），差异有统计学意义（χ2=7.564，P=0.006）。高龄孕妇与非高龄孕妇的病例中，致病性CNVs 的检出率分别是45.16%（14/31）和41.56%（64/154），差异无统计学意义（χ2=1.849，P=0.174）。

3 讨论

目前，有创性产前诊断主要针对高龄、超声异常、血清学筛查高风险等进行诊断[13]，传统采用细胞培养和染色体核型分析。相对于传统方法，CMA 技术分辨率更高，可检出微缺失/微重复，然而CMA 可否替代传统染色体核型分析作为主要产前诊断的方法，质疑一直存在[14]。

表1 NT 增厚病例行染色体核型分析及CMA 结果

本次研究将传统核型分析与CMA 技术联合用于产前诊断，目的是探讨CMA 技术临床应用价值。结果显示：185 例NT 增厚病例，染色体核型分析中染色体异常39 例，CMA 中染色体异常的59 例，“NT 增厚”成为胎儿染色体异常的非特异标志物，NT 厚度与染色体异常和结构异常的发生有直接关系[15-16]。CMA 较染色体核型分析多检测出的微缺失/微重复病例为20 例，13 例为可能致病性或致病性（65%）。CMA 可以检测到所有核型分析检测的染色体异常，并且对微缺失/微重复的额外检出率为10.81%，额外有效疾病诊断为7.03%，为减少出生缺陷提供了一种新型的检测手段。2015 年一些学者对NT 增厚但核型正常的胎儿进行CNVs 分析，得出具有致病性CNVs 的微缺失/微重复检出率达7.7%～8.3%[17-20]，本次实验与此结果相符。在我国≥35 岁的孕妇归为高龄孕妇，高龄是唐氏儿的重要因素之一。唐氏综合征在我国的确诊率仅有2.4/万，而发达国家却高达（8～15）/万。本次实验中高龄孕妇与非高龄孕妇比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），与2019 年Wu 等[21]研究年龄因素在NT 增厚病例中CMA异常检出率无差异相一致。

本实验核型分析共检出嵌合体2 例：①46，XN，t（15；17）（q15；q25）[4]/46，XN[122] 1 例，CMA 检测46，XN，后续检测其父亲染色体出现重合片段，证明染色体正常；虽说平衡重排一般不致病，但对未来妊娠会带来后果[22]。②46XN[5]/47，XN+21，CMA 结果为21 三体综合征。结构异常1 例：46，XN，del（18）（P11），CMA结果18p11.32p11.2 缺失14.94 Mb，P。由此可以看出，CMA 可以检出核型分析中的非整倍染色体异常及对核型结果中未知额外标记染色体（sSMC）的内容和来源得出更明确的信息，但CMA 无法识别平衡重排（易位/倒位/插入）。7 例意义不明VOUS，35%的VOUS 检出会给CMA 的咨询解释带来挑战，我们要不断学习，提高认知水平，努力使自己的认知水平与日新月异的科技发展水平相适应。随着更多大规模前瞻性队列研究和CMA 在产前诊断中的应用，CNV 数据库将不断完善，更多染色体病基因型-表型关系将不断被阐明，CMA 在产前诊断领域将展现更大的应用价值。

表2 39 例异常核型分析与CMA 检测结果比较

综上所述，CMA 技术可提高产前诊断的准确性，但CNV 临床意义的不明确性使产前芯片的临床咨询更具挑战性，随着技术的不断提高和数据的大量积累，CMA 技术将在产前诊断中发挥越来越重要的作用。

表3 20 例核型分析正常与CMA 检测结果比较