固相萃取结合高效液相色谱法测定甘草中6种有效成分的含量

洪 博 陈 刚 赵超阳 徐天娇 孙辑凯 李文静

齐齐哈尔医学院药学院，黑龙江齐齐哈尔 161006

甘草性平，味甘，归十二经，是一种补益中草药，能清热解毒，润肺止咳，有调和诸药性的效果[1-7]。甘草中的主要活性成分有芍药苷、甘草苷、甘草酸等[8-13]。本研究选取已明确药理作用、能代表甘草临床作用的相关成分（芍药内酯苷、芍药苷、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酰芍药苷、甘草酸）作为研究和分析的对象[14-16]。有实验显示，芍药内酯苷具有镇静、抗感染及护肝作用[17]；芍药苷有降低血黏度、改善微循环、抗氧化等多种活性[18]；芹糖甘草苷具有止咳、平喘、化痰的作用[19]；甘草苷能抑制溃疡的形成，并有抗氧化、抗人类免疫缺陷病毒等多种活性[20-24]；苯甲酰芍药苷有抗氧化、抗肝纤维化及抗肿瘤作用[11]；甘草酸有抗感染、抗病毒和抗肿瘤等活性[12]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-1000 型高效液相色谱仪（山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司，含四元梯度泵、在线脱气机）；Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱（北京迪科马科技有限公司）；AL204 型万分之一电子天平（精密度为0.0001 g，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；BJ-150型高速多功能粉碎机（义马市乐亿佳商贸有限公司）。

1.2 试药

对照品芍药内酯苷（160516，纯度＞98%）、芍药苷（160524，纯度＞98%）、芹糖甘草苷（160916，纯度＞98%）、甘草苷（161201，纯度＞98%）、苯甲酰芍药苷（160517，纯度＞98%）、甘草酸（160602，纯度＞98%）均购自北京莱耀生物科技有限公司。甲醇、乙腈（色谱纯，瑞典Oceanpak 公司），磷酸（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司），乙醇（分析纯，天津富宇精细化工有限公司），水（杭州娃哈哈集团）。甘草产地为甘肃（1： 180215；2：1 860402；3：180506）和内蒙古（4： 181014；5： 181109；6：181119），药材均经齐齐哈尔医学院药学院中药教研室郭丽娜教授鉴定为豆科植物甘草的干燥根和根茎，符合《中国药典》2015 年版一部及四部的相关项下规定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

流动相：0.05%磷酸-水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min，10%～22% B；10～32 min，22%～40% B；32～35 min，40%～45%B）；流速：1 mL/min；检测波长：240 nm；进样量：20 μL；柱温：25℃。色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的配制

于10 mL 量瓶中制备6 种待测对照品溶液，加入甲醇溶解、定容，浓度分别为：芍药内酯苷0.92 mg/mL、芍药苷0.47 mg/mL、芹糖甘草苷0.99 mg/mL、甘草苷1.6 mg/mL、苯甲酰芍药苷2.3 mg/mL、甘草酸0.44 mg/mL。

2.3 线性关系

按照“2.1”项下色谱条件测定各对照品溶液的峰面积，见表1。以峰面积为纵坐标（Y），对照品进样浓度（μg/mL）为横坐标（X），绘制得到的6 个活性成分的标准曲线均成良好的线性关系，见表2。

2.4 供试品溶液的制备

甘草药材1.00 g 加入2 g 填料，用10 mL 70%乙醇萃取，滤液用0.22 μm 滤膜过滤，各种填料比较后选择以中性硅藻土为填料。

图1 对照品及甘草样品的高效液相色谱图

2.5 精密度实验

取标准曲线中中间浓度的标准溶液，测定并计算6 个待测药效组分峰面积的RSD 值，连续进样6 次，结果分别为1.23%、0.95%、1.85%、1.21%、0.87%、1.08%，提示仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验

取供试品溶液，分别于配制后0、2、4、8、12、24 h 进样，测定并计算6 个待测药效组分峰面积的RSD 值，结果分别为0.75%、1.12%、0.99%、1.54%、0.81%、1.17%，提示24 h 内供试品溶液稳定性良好。

2.7 重复性实验

制备供试品溶液6 份，测定并计算6 个待测药效组分峰面积的RSD 值，结果分别为1.45%、1.98%、1.56%、0.97%、1.57%、1.48%，提示本方法重复性好。

2.8 加样回收率实验

取6 份已知含量的样品，精密加入6 个待测化合物的对照品溶液，按照供试品溶液的制备进行提取，进样分析，6 个药效组分的平均回收率依次为98.44%、101.25%、96.78%、103.74%、97.85%、95.87%，RSD 值分别为1.98%、3.02%、2.85%、1.99%、2.47%、2.06%。

表1 各对照品的浓度C（mg/mL）及对应的峰面积A

表2 各待测成分的曲线方程及线性关系

2.9 药效组分含量测定

制备6 批来自不同产地甘草药材供试品溶液，进样3 次，测定峰面积，计算含量。见表3。

表3 甘草药材中6 种药效组分含量的高效液相色谱分析（mg/g）

3 讨论

本研究观察了热回流提取等传统方法，最终确定使用固相萃取法进行提取，比较了不同材料的提取率，确定中性硅藻土为吸附剂，以10 mL 70%乙醇为洗脱剂的提取效果最好。

本研究比较了以甲醇-水、乙腈-水及水相中加入醋酸、磷酸为流动相进行梯度洗脱。当以0.05%磷酸-水-乙腈系统为流动相时，6 种成分的峰形对称性明显变好，分离度有所增加，且有较高的灵敏度和合适分析的检测时间。色谱条件还考察了不同的流速，结果显示，流动相流速为1.0 mL/min 时，分离度达到要求且分离时间短。

本研究综合考虑6 个待测成分的最大吸收波长，同时考虑到流动相会对分析造成溶剂峰的影响，结合溶剂的截止波长，最终确定检测波长为240 nm，可以避免一些杂质峰的干扰，为科学全面评价甘草药材质量提供了实验依据。