牛卵形巴贝斯虫病二温式PCR诊断方法的建立

田万年，王妍慧，薛书江，贾立军，张守发

(1. 吉林农业科技学院动物科技学院，吉林 吉林 132101 ； 2. 延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

牛的卵形巴贝斯虫病(Babesiaovata)是由巴贝斯科巴贝斯属的卵形巴贝斯虫寄生于牛红细胞内所引起的寄生虫病[1]。病牛多表现为高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿，多引起死亡[2-3]。我国于1986年在河南省卢氏县牛体内发现本病，随后1994年，在甘肃张家川回族自治县牛体内分离到卵形巴贝斯虫[4]。目前牛卵形巴贝斯虫的诊断主要通过血液涂片，显微镜检查为主，隐性感染牛的血液染虫率较低，显微镜检测易出现漏检和误诊。因此，急需建立一种敏感性高、特异性强，用于该病早期诊断。PCR方法是一种快速、敏感、特异的诊断方法，已广泛应用寄生虫病的诊断[5-6]。二温式PCR方法比常规PCR方法特异性更强，所需时间更少[7]。目前尚未见应用二温式PCR诊断牛卵形巴贝斯虫病的文献报道。本试验根据卵形巴贝斯虫18S rRNA基因序列设计1对引物，建立了二温式PCR方法，为今后牛卵形巴贝斯虫病的诊断和流行病学调查提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源 血液样本采自吉林省珲春地区散养的延边黄牛60份，无菌采集抗凝血，用PBS洗3次。存于-20 ℃备用。同时制作了血液涂片，甲醛固定保存，供染色镜检。牛巴贝斯和双芽巴贝斯虫标准基因组DNA由日本带广畜产大学玄学南教授惠赠。瑟氏泰勒虫基因组DNA由延边大学预防兽医实验室保存。

1.2 主要试剂 全血DNA提取试剂盒、TaqDNA聚合酶、dNTP、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DL-2 000 DNA Marker等，均购自宝生物工程(大连)有限公司。……