敌百虫对奥尼罗非鱼幼鱼的急性毒性及安全浓度评价

辛桂瑜 侯小露 梁敏敏 林文锋 邓少立 刘思妮 徐兰程

(1玉林师范学院生物与制药学院，广西玉林 537000；2广西农业职业技术学院，广西南宁 530007)

罗非鱼(Oreochromis)具有生长快、食性杂、抗病力强等优点，是联合国粮农组织推荐的世界性优良养殖鱼种之一，也是我国重要的水产养殖经济品种[1]。奥尼罗非鱼是雌性尼罗罗非鱼(O.niloticus)和雄性奥利亚罗非鱼(O.aureus)种间杂交获得的雄性率较高的杂交一代[2]。该鱼具有明显的单性优势和杂交优势，因而成为罗非鱼养殖的重要品种。然而近年来，随着养殖规模的扩大和养殖密度的提高，养殖水质不断恶化，导致鱼类疾病频繁暴发，严重制约了罗非鱼养殖业的健康发展[3]。

敌百虫，化学名称为O,O-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羟基乙基)膦酸酯，属有机磷酯类化合物，具有高效、低毒及低残留等特点，在水产养殖生产中常用于防治鱼类的寄生虫病[4]。敌百虫主要起到胃毒作用，兼有触杀作用，可防治多种害虫，一般加工成粉剂、乳剂使用，水产上一般使用晶体敌百虫。虽然敌百虫在农药中被列为低毒产品，但是鱼类可经食道、呼吸系统及皮肤接触吸收过量的敌百虫而导致中毒[5]。

目前已有敌百虫对多种鱼类毒性作用的研究报道[6-8]，但是对奥尼罗非鱼毒性作用的报道较少。由于在碱性条件下，敌百虫脱去氯化氢会转化成“敌敌畏”，其毒性会大大增强。因此，本试验分别采用曝气自来水和池塘水两种pH不同的水，通过96 h半静水式方法对奥尼罗非鱼进行急性毒性试验，以确定在曝气自来水和池塘水条件下敌百虫对奥尼罗非鱼的半致死浓度和安全浓度，为罗非鱼养殖生产提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验用奥尼罗非鱼幼鱼购于玉林市鱼联苗种场。试验前将罗非鱼放在盛有曝气4 d的自来水的鱼缸中暂养3 d，暂养期间充分增氧，投喂碾碎的罗非鱼膨化饲料，每天饲喂2次，早晚各1次。试验前24 h停止投饲。选择体态正常、颜色鲜亮、健康活泼、大小一致的个体用于试验。试验鱼体长2.8～3.0 cm，体质量0.48～0.50 g。曝气组试验用水为曝气4 d以上的自来水，水温(23.5±2.0)℃，pH为6.5，溶解氧>5 mg/L；池塘组试验用水为养殖池塘水，水温(23.5±2.0)℃，pH为8.5，溶解氧>5 mg/L。

1.2 试验药品和仪器设备

晶体敌百虫为远城康源兽药有限公司产品，将其配制成质量浓度为1 mg/L的母液，试验时按比例稀释成所需的质量浓度[9]。试验仪器设备有增氧机，电子天平，温度计等，试验用容器为容积5 L的塑料盆(上口直径37.5 cm，下底直径20.5 cm，高12.0 cm)。

1.3 试验方法

参考有关资料[7-10]开展预试验。曝气组(A组)和池塘组(B组)各设置6个敌百虫质量浓度，每个浓度投放10尾试验鱼，观察24 h内试验鱼的死亡情况，得到24 h的100%死亡浓度和0%死亡浓度，以此确定药物试验浓度的上下限。

根据预试验得到的试验浓度上下限，曝气组(A组)和池塘组(B组)按等对数间距各设置6个浓度组和1个空白对照组。曝气组敌百虫质量浓度为1.35、1.82、2.45、3.31、4.47、6.03 mg/L；池塘组敌百虫质量浓度为0.01、0.14、0.21、0.31、0.46、0.68 mg/L。每个5 L塑料盆内放入10尾奥尼罗非鱼。试验期间不投饲，每24 h更换1次试验药液，发现有死亡的试验鱼及时捞出。试验开始8 h后，定时观察试验鱼的中毒情况及死亡症状[10]，并记录24、48、72、96 h鱼的死亡数量。如试验鱼长时间无肉眼可见动作，用小镊子夹住鱼的尾柄部，其对外界刺激无反应即可判断该鱼已经死亡。

1.4 数据处理

试验数据采用EXCEL软件进行处理，分别建立不同暴露时间(24、48、72、96 h)敌百虫质量浓度与奥尼罗非鱼死亡率之间的线性回归方程，根据回归方程分别计算奥尼罗非鱼在相应暴露时间的半致死浓度(LC50)[11-13]。

安全浓度(SC)的计算公式[14]如下。

SC=0.1×96 h LC50

(1)

2 结果和分析

2.1 曝气自来水条件下敌百虫对奥尼罗非鱼的急性毒性

试验期间观察发现，对照组的奥尼罗非鱼一直表现正常。6个试验组的奥尼罗非鱼起初活动情况均为正常，8 h后，A3、A4组奥尼罗非鱼开始表现异常，游动变缓，慢慢地在水面漂游，鱼体或静卧或侧卧，逐渐失去平衡，尾部缓缓摆动，嘴巴慢慢张合，A5、A6组试验鱼中毒表现较为明显，出现兴奋状态，狂游乱窜，活动剧烈，不时撞击塑料盆壁；12 h后，A3、A4、A5、A6组奥尼罗非鱼均呈现出兴奋状态，开始毫无目的地急速游动，鱼体渐渐失去平衡。随着试验时长增加，中毒的奥尼罗非鱼出现抽搐现象，呼吸停止，最后侧翻死去，漂浮在水面。死亡后的奥尼罗非鱼身体僵直，体色变黑，眼球突出并出现白色薄膜，鳃盖出血，鳃盖和口部张开。

曝气自来水条件下敌百虫对奥尼罗非鱼的毒性试验结果见表1。对照组没有出现死亡，A1、A2组在24、48 h没有出现死亡，72 h出现死亡，A3、A4、A5、A6组在24 h出现死亡，而敌百虫质量浓度最高的A6组24 h试验鱼即全部死亡。

将试验结果使用EXCEL软件做线性回归处理。以x为药物的质量浓度，y为死亡鱼尾数，得到线性回归方程，并计算出敌百虫对奥尼罗非鱼的半致死浓度(LC50)和安全浓度(SC)，结果见表2。

由表2可见，在同样的试验时长内，敌百虫质量浓度越高，对奥尼罗非鱼的毒性就越大，奥尼罗非鱼的死亡率越高；同一质量浓度下，试验时间越长，奥尼罗非鱼死亡率越高。结果显示，曝气自来水条件下敌百虫对奥尼罗非鱼24、48、72、96 h的半致死质量浓度分别为3.68、3.31、2.05、1.57 mg/L，安全质量浓度为0.157 mg/L。

2.2 池塘水条件下敌百虫对奥尼罗非鱼的急性毒性

试验期间，对照组的奥尼罗非鱼表现正常，没有出现死亡。池塘水样采集时间为16：00，池塘水24 h内pH的变化范围为8.5～7.8，呈缓慢降低趋势。试验开始时，6个试验组的奥尼罗非鱼活动情况均正常，8 h后，B1、B2、B3组试验鱼开始表现异常，游动变得缓慢，鱼体静卧或侧卧，在水面漂游，开始失去平衡，尾部缓缓摆动，嘴巴慢慢张合；B4、B5、B6组试验鱼中毒表现较为明显，出现兴奋状态，狂游乱窜，游动剧烈，不时地撞击塑料盆，此时测得水体pH为8.2。12 h后，pH降为8.0，B3、B4、B5、B6组试验鱼表现出兴奋状态，毫无目的地急速游动，鱼体逐渐失去平衡，在水中翻滚。随着试验时长增加，中毒的奥尼罗非鱼开始抽搐，停止呼吸，最后侧卧死去，漂浮于水面。死亡后的鱼体僵直，体色变白，眼球突出并出现白色薄膜，鳃盖出血，鳃盖和口部张开。

表1 曝气自来水条件下敌百虫对奥尼罗非鱼幼鱼的毒性试验结果

表2 曝气自来水条件下敌百虫对奥尼罗非鱼幼鱼的半致死浓度(LC50)及其安全浓度(SC)

表3 池塘水条件下敌百虫对奥尼罗非鱼幼鱼的毒性试验结果

池塘水条件下敌百虫对奥尼罗非鱼的毒性试验结果见表3。对照组没有死亡，B1组在24 h、48 h均没有试验鱼死亡，72 h试验鱼出现死亡。B2、B3、B4、B5、B6组在试验开始后24 h试验鱼就出现死亡，而敌百虫质量浓度最高的B6组，24 h试验鱼即全部死亡。

将试验结果使用EXCEL软件做线性回归处理。以x为药物的质量浓度，y为死亡鱼尾数，得到线性回归方程，并计算出敌百虫对奥尼罗非鱼的半致死浓度(LC50)和安全浓度(SC)，结果见表4。

由表4可见，在同样的试验时长内，敌百虫质量浓度越高，对奥尼罗非鱼幼鱼的毒性就越大，鱼的死亡率越高；同一质量浓度下，试验时间越长，奥尼罗非鱼死亡率越高。结果显示，在池塘水条件下敌百虫对奥尼罗非鱼24、48、72、96 h的半致死质量浓度分别为0.35、0.29、0.17、0.13 mg/L，其安全质量浓度为0.013 mg/L。

表4 池塘水水条件下敌百虫对奥尼罗非鱼幼鱼的半致死浓度(LC50)及其安全浓度(SC)

3 讨论

3.1 敌百虫对鱼类的毒性机理

有研究表明，给药3 h后，敌百虫的浓度在大脑组织中是最高的，然后会集中于脊髓和肌肉组织[15]。有资料表明，如鱼类长期接触低浓度的敌百虫，不但体内胆碱脂酶的活性会被抑制，而且还会损害肝、肾及体内细胞的遗传物质。敌百虫对水生动物的杀灭作用是其水解产物“敌敌畏”所致。“敌敌畏”是1种胆碱脂酶抑制剂，能抑制生物体内胆碱脂酶的活性，使机体失去水解破坏乙酸胆碱的能力，进而使鱼类、昆虫、甲壳类等生物神经失常而死亡。此外，敌百虫还能使鱼体的周围神经系统麻痹，发生迟发性神经病变[16]。在本试验中，奥尼罗非鱼表现出明显的运动失常，出现了狂游、乱窜、失去方位感及无法控制身体等症状，与一些文献资料中报道的相符。

3.2 敌百虫与水体pH的关系

敌百虫是1种高效低毒类杀虫剂，在渔业生产中被广泛使用。但敌百虫在杀死敌害生物的同时，对养殖鱼类也有一定的毒害作用，特别是在碱性条件下，敌百虫脱去氯化氢会转化成“敌敌畏”，其毒性增加10～15倍。敌百虫脱去氯化氢转化为“敌敌畏”的过程随着水体pH的升高而加快[17]。在本试验中，曝气自来水与池塘水在pH上有明显的差别，曝气自来水24 h内的pH保持在6.5左右，而池塘水试验开始24 h内的pH在7.8～8.5。试验结果显示，在池塘水条件下敌百虫的安全浓度(0.013 mg/L)明显要低于曝气自来水条件下的安全浓度(0.157 mg/L)，二者相差约12倍，因此，在池塘养殖生产中使用敌百虫时应根据水体的pH严格控制使用浓度。养殖水体的pH往往会不断变化，如敌百虫使用时机不当会导致养殖鱼类死亡。此外，敌百虫对奥尼罗非鱼的急性毒性还应考虑水温、溶解氧、鱼体大小等因素，本试验测得的半致死浓度和安全浓度结果在生产上仅作参考。

3.3 “敌敌畏”对鱼类的毒性机理

“敌敌畏”由敌百虫脱去氯化氢转化而成，是1种神经性杀虫剂，其作用机制主要是通过抑制脑突触体膜上的腺苷，使突触体膜上的乙酰胆碱酯酶等神经递质大量聚集，从而使脑乙酰胆碱酯酶被抑制[18-19]。“敌敌畏”对鱼类作用的研究报道较少。根据报道[20-22]，“敌敌畏”对鲫鱼幼鱼48、72、96 h的半致死浓度分别为45.1、30.4、23.3 mg/L，安全浓度为2.3 mg/L；对金鱼24、48、72、96 h的半致死浓度分别为39.17、33.65、27.10、25.94 mg/L，安全浓度为2.5 mg/L；对草鱼的96 h半致死浓度为21.9 mg/L，安全浓度为2.19 mg/L。本试验结果表明，在池塘水条件下敌百虫对奥尼罗非鱼的96 h半致死浓度为0.13 mg/L，安全浓度为0.013 mg/L，说明奥尼罗非鱼对敌百虫的耐受能力较差，因此对“敌敌畏”的耐受能力也差，少量的“敌敌畏”就可能导致奥尼罗非鱼死亡。

3.4 敌百虫的安全使用方法

本试验结果表明，在池塘水条件下奥尼罗非鱼幼鱼对敌百虫较敏感，其安全浓度仅为0.013 mg/L，与曝气自来水条件下得出的安全浓度相差12倍左右。所以，作为奥尼罗非鱼的鱼病防治药物，使用敌百虫时应当严格控制用量，在使用前应进行测试。根据敌百虫对鱼类毒性的作用规律，其毒性随着水体pH的升高而加强，因此在生产中使用敌百虫治疗鱼病或控制浮游生物时，应根据水体pH的变化调整其使用剂量。由于光合作用，池塘水体的pH具有明显的昼夜变化规律，表现为早晨(4：00—8：00)较低，下午(14：00—16：00)较高，pH变化范围为7.8～8.5。因此，施用敌百虫最好选择在晴天早晨6：00或晚上22：00进行。通常在晴天的早晨，浮游植物光合作用较弱，水体pH较低，傍晚pH又开始下降，至翌日凌晨降至最低。因此，在晴天早晨6：00或晚上22：00施药，敌百虫能逐渐发挥作用并逐步降解，至pH达到高峰时，敌百虫已基本降解完毕，不易形成突发性“敌敌畏”高峰。此外，还必须考虑敌百虫的累积作用，一般水体pH越低，敌百虫残留的时间越长[23]。因此，养殖池塘中不能在短时间内反复多次使用敌百虫，施用敌百虫后也不能施放碱性的药物或水体改良剂，以免水体pH突然升高。

4 结论

本试验在水温(23.5±2.0)℃、溶解氧>5 mg/L的条件下，分别研究了曝气自来水(pH为6.5)和池塘养殖水(pH为8.5)中敌百虫对奥尼罗非鱼的急性毒性效应。结果表明，在曝气自来水条件下，敌百虫对奥尼罗非鱼24、48、72、96 h的半致死浓度质量分别为3.68、3.31、2.05、1.57 mg/L，安全质量浓度为0.157 mg/L；在池塘水条件下，敌百虫对奥尼罗非鱼24、48、72、96 h的半致死质量浓度分别为0.35、0.29、0.17、0.13 mg/L，安全质量浓度为0.013 mg/L。在池塘水条件下敌百虫对奥尼罗非鱼的毒性比在曝气自来水中强，其安全浓度也相差约12倍，这一结果可为奥尼罗非鱼养殖及水生毒理效应试验提供参考。