异氟醚对脑缺血再灌注大鼠侧支循环形成及Notch通路的影响

张 敏，项明琼，油文静，伍 璀

(1.同济大学附属杨浦区中心医院麻醉科，上海 200082 2.复旦大学附属华山医院北院麻醉科，上海 200082)

脑中风是一组以脑部缺血及出血性损伤症状为主要临床表现的疾病，又称脑卒中或脑血管意外，具有极高的病死率和致残率，主要分为出血性脑中风(脑出血或蛛网膜下腔出血)和缺血性脑中风(脑梗塞、脑血栓形成)两大类，以脑梗塞最为常见[1]。脑缺血/再灌注(I/R)损伤包括缺血期的原发性损伤和再灌注期间的继发性损伤，可能形成脑水肿并加重由多种因素引起的脑损伤，包括细胞膜损伤，兴奋性氨基酸毒性和中性粒细胞活化[2]。颅内侧支循环在缺血性中风的发生、发展、治疗和预后中起着极其重要的作用。研究表明，异氟醚常用于镇静和麻醉处理的缺氧缺血性脑病，并激活神经元的多核或抑制某些神经信号通路，异氟醚处理可以减少缺氧缺血性脑损伤，并起到类似于缺血预处理的作用[3]。Notch家族是多功能相互作用的细胞因子超家族，由30多种蛋白质组成。在细胞中，Notch家族成员涉及一系列由前体蛋白产生的生物学效应；Notch也通过两种形式分泌到细胞外膜中[4]。Notch1信号转导过程涉及I型受体的激活，Smad蛋白(Smad)、磷酸化的Smad蛋白和转化生长因子-β(TGF-β)组合从Smad复杂易位到核调节mRNA下游信号蛋白的转录。血管内皮生长因子(VEGF)也是Notch1调控下的细胞因子[5]。本研究拟探讨异氟醚对脑缺血再灌注大鼠侧支循环形成及Notch通路的影响，为脑缺血再灌注的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1主要药物、试剂及仪器:异氟醚(美国sigma公司，批号M5474)；依达拉奉注射液(国药集团国瑞药业有限公司，规格30mg/支，批号20190813)；Trlzol试剂、cDNA合成试剂盒(杭州博日科技有限公司，批号BSC51M1、BSB09M1)；SYBR Premix Ex Taq实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(宝日医生物技术(北京)有限公司，批号DRR041A)；放射免疫沉淀分析裂解液(北京欣华绿源科技有限公司，批号SS0892；BCA蛋白测定试剂盒(美国Pierce公司，批号BI548854)；10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳膜(碧云天生物技术研究所，批号EN545465)；聚偏二氟乙烯膜(美国赛默飞世公司，批号BT12654)；Notch1、VEGF、β-actin一抗(美国Abcam公司，批号ab46182、ab39973、ab00113)；辣根过氧化物酶标记的二抗(西化仪(北京)科技有限公司，批号BBY193)；增强的化学发光检测试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司，批号HR0340-UHF)。WE098型病理包埋机、WS96病理切片机(德国徕卡公司)；CKX53型倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)；ABI7500型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；TZL-650WK型超声破碎仪(苏州珀西瓦尔实验设备有限公司)；GelView 5000 Pro型凝胶成像分析系统(广州博鹭腾生物科技有限公司)。

1.2实验动物及分组:清洁级SD(Sprague Dawley)大鼠90只，年龄8周；重量180～220g，不拘雌雄，由昆明医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(云)2018-0012，动物质量合格证号：SC-19061209。本研究经同济大学附属杨浦区中心医院伦理委员会批准。大鼠饲养环境：温度22～24℃，湿度50～60%，光照12/12循环；适应性饲养1周。大鼠按随机数字表法分成5组：对照组、模型组、依达拉奉组(3mg/kg)、异氟醚低剂量组(50μg/kg)、异氟醚高剂量组(100μg/kg)，每组18只。

1.3动物模型制备及给药:模型组、依达拉奉组、异氟醚低、高剂量组腹腔注射戊巴比妥腹麻醉后，通过大脑中动脉阻塞(MCAO)方法诱发局灶性脑缺血-再灌注损伤。对照组的大鼠接受相同的手术程序，只是未阻塞颈动脉。依达拉奉组、异氟醚低、高剂量组造模成功后第1天开始分别腹腔注射3mg/kg的依达拉奉、50μg/kg的异氟醚、100μg/kg的异氟醚，(给药体积均为10mL/kg)，每天1次，持续给予1周，对照组和模型组腹腔注射等体积生理盐水(给药体积10mL/kg)。

1.4大鼠脑缺血再灌注区域微血管密度及病理结果观察:实验结束后处死大鼠，获取脑缺血再灌注区域组织，HE染色常规制作病理切片；计数镜下微血管数目并观察脑缺血再灌注区域病理改变。

1.5神经运动功能评分、双侧贴纸去除及平衡木过杆实验:实验结束后，以盲控方式记录缺血性损伤后的每只大鼠的神经运动功能评分，采用以下评分制度：0分，未见任何神经功能缺失；1分，拿着尾巴提起老鼠前爪未能伸展；2分，行走时，身体右倾或向右旋转；3分，行走时，身体向右侧跌倒；4分，无法自发行走，或意识水平降低；得分越高表示神经运动功能越差。依据相关文献对大鼠行双侧贴纸去除及平衡木过杆实验[6]。

1.6大鼠脑缺血再灌注区域组织Notch1、VEGF mRNA表达的测定:Trlzol试剂从脑缺血再灌注区域组织中分离总RNA，在提取总RNA后进行逆转录，使用逆转录第一链cDNA合成试剂盒将总RNA转化为cDNA。在ABI7500型PCR仪上使用SYBR Premix Ex Taq实时荧光定量PCR试剂盒进行qRT-PCR。引物由宝日医生物技术(北京)有限公司合成。序列如下：Notch1上游(5'-CTGGAGCCAGCATGAATCCAG-3')和下游(5'-TTCTTCTCTTCTCCACGGTCA-3')；VEGF上游(5'-AGAAATGGTGCCTGGACACCTCAT-3')和下游(5'-TGGTCCCGGTTGTACAGTCCTAAT-3′)；β-actin上游(5'-AGAAATGGTGCCTGGACACCTCAT-3')和下游(5'-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGATC-3')。β-actin为内参基因。PCR总反应体系(20 μL)为：SYBR Premix Ex Taq 8 μL，cDNA模板 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，去离子水8 μL。热循环参数为：97℃ 45s，56℃ 42s，73℃ 40s，70℃ 15min。每个样品进行三次测量。2-△△Ct法用于计算Notch1、VEGF mRNA的相对表达水平。

1.7大鼠脑缺血再灌注区域组织Notch1、VEGF蛋白表达的测定:将脑缺血再灌注区域组织通过超声破碎仪压碎，并与放射免疫沉淀分析裂解液混合。然后，使用BCA蛋白测定试剂盒确定相关蛋白浓度。通过10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白，并转移至聚偏二氟乙烯膜。将含有蛋白质的膜在室温下孵育2h，然后与Notch1、VEGF、β-actin一抗(稀释比均为1∶1000)一起在4℃过夜孵育。然后，将膜用含Tween 20的Tris缓冲盐水洗涤三次，并与辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5000稀释)孵育，使用增强的化学发光检测试剂盒进行显影。使用凝胶成像分析系统进行扫描和分析蛋白质印迹带。β-actin作为内参蛋白。

2 结 果

2.1各组大鼠脑缺血再灌注区域微血管密度比较:与对照组比较，模型组脑缺血再灌注区域微血管密度降低(P<0.05)；与模型组比较，依达拉奉组、异氟醚低剂量组、异氟醚高剂量组脑缺血再灌注区域微血管密度升高(P<0.05)；且异氟醚高剂量组脑缺血再灌注区域微血管密度高于异氟醚低剂量组(P<0.05)；异氟醚高剂量组脑缺血再灌注区域微血管密度与依达拉奉组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠脑缺血再灌注区域微血管密度比较

2.2各组大鼠神经运动功能评分、双侧贴纸去除及平衡木过杆时间比较:与对照组比较，模型组神经运动功能评分、双侧贴纸去除时间、平衡木过杆时间升高(P<0.05)；与模型组比较，依达拉奉组、异氟醚低剂量组、异氟醚高剂量组神经运动功能评分、双侧贴纸去除时间、平衡木过杆时间降低(P<0.05)；且异氟醚高剂量组神经运动功能评分、双侧贴纸去除时间、平衡木过杆时间低于异氟醚低剂量组(P<0.05)；异氟醚高剂量组神经运动功能评分、双侧贴纸去除时间、平衡木过杆时间与依达拉奉组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠神经运动功能评分双侧贴纸去除及平衡木过杆时间比较

2.3各组大鼠脑缺血再灌注区域神经元结构的比较:对照组神经元细胞完整；模型组海马区可见大量坏死神经元，神经细胞核固缩，有明显炎症细胞浸润；依达拉奉组、异氟醚高剂量组神经元细胞结构较为完整，炎症细胞浸润减少；异氟醚低剂量组仍可见明显炎症细胞浸润。见图1。

2.4各组大鼠脑缺血再灌注区域组织Notch1、VEGF mRNA表达水平比较:与对照组比较，模型组脑缺血再灌注区域组织Notch1、VEGF mRNA表达降低(P<0.05)；与模型组比较，依达拉奉组、异氟醚低剂量组、异氟醚高剂量组脑缺血再灌注区域组织Notch1、VEGF mRNA表达升高(P<0.05)；且异氟醚高剂量组脑缺血再灌注区域组织Notch1、VEGF mRNA表达高于异氟醚低剂量组(P<0.05)；异氟醚高剂量组脑缺血再灌注区域组织Notch1、VEGF mRNA表达与依达拉奉组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠脑缺血再灌注区域组织Notch1 VEGF mRNA表达水平比较

2.5各组大鼠脑缺血再灌注区域组织Notch1、VEGF蛋白表达水平比较:与对照组比较，模型组脑缺血再灌注区域组织Notch1、VEGF蛋白表达降低(P<0.05)；与模型组比较，依达拉奉组、异氟醚低剂量组、异氟醚高剂量组脑缺血再灌注区域组织Notch1、VEGF蛋白表达升高(P<0.05)；且异氟醚高剂量组脑缺血再灌注区域组织Notch1、VEGF蛋白表达高于异氟醚低剂量组(P<0.05)；异氟醚高剂量组脑缺血再灌注区域组织Notch1、VEGF蛋白表达与依达拉奉组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4、图2。

表4 各组大鼠脑缺血再灌注区域组织Notch1 VEGF蛋白表达水平的比较

图1 各组大鼠脑缺血再灌注区域神经元结构病理图(HE染色，200倍)

图2 各组大鼠脑缺血再灌注区域组织Notch1、VEGF蛋白印迹图

3 讨 论

异氟醚是临床上广泛使用的吸入麻醉药之一，已证实异氟醚具有神经保护作用。现有研究表明低浓度的异氟醚预处理可以在较短的时间内为缺血性损伤提供保护[7]。研究发现异氟醚可抑制血小板聚集和粘附并减少炎症；在中风后弥漫性脑肿胀的早期，高剂量的异氟醚可以增加微循环并改善总体预后，减少梗塞体积并激活神经营养因子分泌。本次研究显示，异氟醚低剂量组、异氟醚高剂量组脑缺血再灌注区域微血管密度高于模型组；这说明异氟醚能明显促进脑缺血再灌注大鼠侧支循环形成。此外对大鼠神经运动功能分析显示，异氟醚低剂量组、异氟醚高剂量组神经运动功能评分、双侧贴纸去除时间、平衡木过杆时间低于模型组；说明异氟醚对脑缺血再灌注大鼠神经运动功能具有恢复作用，侧支循环是脑缺血再灌注的重要预后因素。研究表明，与没有侧支循环的患者相比，代偿性侧支循环良好的急性脑梗死患者灌注面积小，早期临床症状明显改善[8]。此外，侧支循环有助于预测血管内治疗的疗效以及最终的梗塞面积和出血性转化的风险。这些研究均与本研究结果一致。此外，病理学结果显示，依达拉奉组、异氟醚高剂量组神经元细胞结构较为完整，炎症细胞浸润减少；异氟醚低剂量组仍可见明显炎症细胞浸润，说明异氟醚能减轻脑缺血再灌注大鼠缺血梗死灶炎症反应。

Notch1在神经干细胞中高度表达，并调节神经发育和树突形态，Notch1信号通路在体内和体外缺血后均被激活，具有神经修复功能。研究表明，Notch1的激活可以促进缺血性中风后神经细胞的增殖和分化。此外，Notch信号传导促进中风后巨噬细胞的活化和树突状细胞的分化。Notch信号传导有助于维持核因子κB(NF-κB)活化，并增强炎症反应，Notch1可在局灶性脑缺血后激活小胶质细胞，能够介导炎症，清除受损的神经元并修复缺血后的损伤[9]。研究表明，Notch1的非典型信号传导途径激活了非Smad依赖性的转导途径，从而改变了细胞的生物学特性，丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)途径是非Smad依赖性途径[10]。作为MAPK信号通路的成员VEGF是细胞增殖和凋亡调控的关键途径，VEGF通路是血管生成的重要途径[11]。本次研究显示，异氟醚低剂量组、异氟醚高剂量组脑缺血再灌注区域组织Notch1、VEGF mRNA和蛋白表达高于模型组；且异氟醚高剂量组脑缺血再灌注区域组织Notch1、VEGF mRNA和蛋白表达高于异氟醚低剂量组。这与上述讨论一致，同时说明异氟醚可促进大鼠脑缺血再灌注区域组织Notch1、VEGF mRNA和蛋白表达水平的表达进而激活Notch信号通路。综上所述，异氟醚能明显促进脑缺血再灌注大鼠侧支循环形成；其机制可能与异氟醚可促进大鼠脑缺血再灌注区域组织Notch1、VEGF mRNA和蛋白的表达进而激活Notch信号通路有关。