右美托咪定对顺铂诱导的非小细胞肺癌细胞凋亡及氧化应激的影响

任 斐 王 敏 徐小矛

肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，从临床角度出发，结合肺癌的生物学特性，可将其分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)[1]。SCLC约占所有肺癌的15%，而NSCLC占85%，且NSCLC对放疗和化疗的敏感性明显低于SCLC。NSCLC主要包括肺腺癌、肺鳞癌和肺大细胞癌[2]。由于肺癌早期临床表现不明显，发现较晚，肿瘤细胞已发生淋巴转移和远处转移，死亡率极高，预后也较差，5年生存率仅为15%～20%，严重威胁人类的生命健康[1]。顺铂是目前治疗肺癌最常用的一线化疗药物，但是因其严重的毒副作用和耐药性的产生限制了它的应用[3]。因此增强癌细胞对顺铂的敏感性，降低顺铂耐药性，对NSCLC治疗起至关重要的作用。右美托咪定(Dex)是1种有效的 2肾上腺素能激动剂，具有镇静、镇痛、阻滞交感神经等作用。近期的研究表明，Dex可促进SKOV3卵巢癌细胞的凋亡，减弱细胞的迁移和侵袭[4]。但是对其在肺癌细胞顺铂耐药性中的作用却甚少报道，本研究旨在探讨Dex对肺癌细胞顺铂耐药性的影响，并试图分析其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及分组

人非小细胞肺癌细胞系NCI-H23购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，将细胞培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，与37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养。取对数生长期的细胞分为3组：对照组、顺铂组和Dex组。各组干预方式。顺铂组：采用3 g/ml的顺铂孵育24 h；Dex组：先用1 nM的Dex孵育15 min，然后再用3 g/ml的顺铂孵育24 h；对照组用加入同剂量的培养基孵育24 h。顺铂和Dex均购自美国Sigma公司。

1.2 Western Blot

采用RIPA试剂从各组细胞中提取总蛋白，BCA试剂盒对总蛋白进行定量。取20 g的总蛋白加入上样缓冲液中，用10%的SDS-PAGE凝胶分离总蛋白。经转膜后用5%的BSA封闭45 min，孵育1抗，4 ℃过夜。孵育辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5000)，室温摇床孵育45 min。化学发光试剂ECL暗室发光。条带及数据的分析采用美国Bio-rad公司的凝胶成像系统以及Quantity One 4.6.2软件。一抗及稀释倍数为：Cytochrome C抗体(1∶1000)、Cleaved Caspase-3抗体(1∶800)、Bax抗体(1∶800)、Bcl-2抗体(1∶1000)、mTOR抗体(1∶800)、ERK1/2抗体(1∶1000)、Phospho-Erk1(Thr202/Tyr204)/Erk2(Thr185/Tyr187)抗体(1∶600)、E-钙粘蛋白抗体(1∶600)以及内参-actin(1∶5000)均购自上海碧云天公司，Cleaved Caspase-9抗体(1∶1000)和p(S2448)-mTOR抗体(1∶600)购自美国Abcam公司。

1.3 活性氧(ROS)含量的检测

采用活性氧检测试剂盒检测各组细胞中ROS的含量，试剂盒购自上海碧云天公司。将收集的细胞悬浮于10 mol/l的DCFH-DA稀释液中，调整细胞浓度为1×107个/ml。于37 ℃培养箱中培养20 min后，无血清培养液洗3次，应用荧光酶标仪在激发波长488 nm，发射波长525 nm处检测荧光强度。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 Dex对顺铂诱导的肺癌细胞凋亡相关蛋白表达的影响

与对照组相比，顺铂组和Dex组Caspase 3、Caspase 9和Bax的表达显著增加(P<0.05)，Dex组高于顺铂组(P<0.05)。与对照组相比，顺铂组和Dex组Bcl-2表达显著降低(P<0.05)，顺铂组和Dex组间比较无显著差异，见表1。

表1 各组Caspase 3、Caspase 9、Bax和Bcl-2表达水平对比

2.2 Dex对顺铂诱导的肺癌细胞ROS产生和细胞色素C释放、E-钙粘蛋白表达及mTOR/ERK1/2信号途径激活的影响

与对照组相比，顺铂组和Dex组ROS的含量及细胞色素C的释放显著增加(P<0.05)，Dex组高于顺铂组(P<0.05)。Dex组p-mTOR的表达显著低于对照组和顺铂组(P<0.05)，对照组和顺铂组间比较无显著差异。与对照组相比，顺铂组和Dex组p-ERK1/2的表达显著降低(P<0.05)，Dex组低于顺铂组(P<0.05)。各组间mTOR和ERK1/2的表达无显著差异。Dex组E-钙粘蛋白的表达显著低于对照组和顺铂组(P<0.05)，对照组和顺铂组间比较无显著差异(P>0.05)，见表2。

表2 各组ROS、细胞色素C、E-钙粘蛋白、mTOR/ERK1/2信号途径激活含量的对比

3 讨论

虽然已经报道了Dex具有促进SKOV3卵巢癌细胞凋亡的作用，但矛盾的是，在关于Dex和顺铂的研究中显示，Dex可以降低顺铂处理后肾组织中Bax的表达及p53和caspase-3的活性[5]，表明Dex具有抗凋亡的作用，因此，Dex在癌细胞中的作用还有待进一步研究。本研究中显示，Dex可进一步增加顺铂诱导的促凋亡蛋白Caspase 3、Caspase 9和Bax表达的增加，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，表明Dex可激活肺癌细胞的内在凋亡途径。Dex可上调肺癌细胞线粒体中Bax/Bcl-2的比值，导致线粒体跨膜电位消失，线粒体渗透转运孔开放，导致细胞色素C从线粒体释放至细胞质，caspase 9自剪接而激活，再依次激活caspase 3等，直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起细胞凋亡[6]。本研究中接下来对细胞色素C的研究也证明了这一点，Dex可促进顺铂诱导的肺癌细胞中细胞色素C的释放，进而导致caspase瀑布式激活，诱导凋亡。由于Dex是 2肾上腺素能激动剂，因此Dex的促凋亡作用可能与 2肾上腺素能的激活有密切关系，但具体的作用效果及机制还有待进一步探讨。

细胞色素C的释放常常伴随ROS的产生，在生物学上，ROS是体内一类氧的单电子还原产物，是电子在未能传递到末端氧化酶之前漏出呼吸链并消耗大约2%的氧生成的，主要包括超氧阴离子自由基(O2-)、H2O2、羟基自由基(OH-)和次卤酸(如次氯酸)[7]。在本研究中，Dex可进一步促进顺铂诱导的肺癌中ROS的水平，表示Dex的促凋亡作用可能与氧化应激有关。ROS可介导多种细胞信号转导途径，包括细胞增殖途径及血管生成途径[8]。mTOR和ERK1/2参与癌细胞的增殖/存活途径[9]，本研究显示，顺铂可显著抑制ERK1/2的活性，但是对mTOR的活性无显著影响。而Dex可进一步抑制顺铂导致的mTOR和ERK1/2蛋白失活，表明其可进一步增强顺铂对肺癌细胞增殖的抑制作用，增强肺癌细胞对顺铂的敏感性，对肺癌的治疗具有积极作用。

此外，细胞表面粘附分子E-钙粘蛋白在细胞内部与细胞骨架成分连接，在细胞表面提供细胞膜之间的连接，因此对细胞与细胞的附着作用至关重要，在肿瘤细胞的转移过程中起重要的促进作用[10]。本研究中，顺铂对E-钙粘蛋白的表达无显著影响，但是Dex可显著抑制肺癌细胞中E-钙粘蛋白的表达，提示Dex可能通过抑制E-钙粘蛋白的表达进而在阻止肺癌细胞转移过程中起重要作用，但是具体的结果还有待进一步研究。

本研究已经阐明了Dex对顺铂诱导的肺癌细胞凋亡具有促进作用。但是也存在一些局限性，这些局限性值得进一步研究：①关于mTOR和ERK1/2信号通路的研究，可用特异性抑制剂去阻断信号通路，这样可以针对性地探索这些通路在细胞活动中的作用。②关于Dex对肺癌细胞中ROS产生的研究，还需要进一步的研究来验证Dex对氧化应激的影响，包括Dex对抗氧化酶(SOD，GPX和CAT)的影响。高水平的ROS通常对细胞有不利作用，但是癌细胞的氧化还原状态与正常细胞的氧化还原状态有所不同。由于代谢和信号转导异常，导致癌细胞中ROS水平增加，进而阻止肿瘤的发展。但是ROS还可通过诱导DNA突变和促癌基因信号转导途径促进肿瘤形成。这些矛盾的影响预示着调节ROS水平在潜在的抗癌策略中具有重要意义[11]。因此Dex对氧化应激的调节作用可能作为治疗癌症的新策略[11-12]。

总之，本研究通过体外实验表明Dex可进一步促进顺铂诱导的肺癌细胞凋亡，机制可能与其抑制mTOR和ERK1/2增殖信号通路的活性及抑制E-钙粘蛋白的表达有关。