B7H3、B7H4在上皮性卵巢癌组织及血清中的表达及其临床意义

张丽静 薛惠英 胡 捷

卵巢癌作为女性最常见的恶性肿瘤之一，5年生存率仅40%，寻找有效可靠的生物标志物对该病的病情及预后进行判断具有重要的临床价值[1-2]。B7H3、B7H4蛋白均属于B7蛋白超家族成员，在免疫系统中可通过抑制T细胞或巨噬细胞功能参与抗肿瘤免疫反应，影响肿瘤的增殖及免疫调控过程。在肺癌、乳腺癌等实体肿瘤中，B7H3、B7H4蛋白已被证明对肿瘤的病理分期及预后具有一定的判断价值[3-4]。在卵巢癌的免疫治疗中，同属B7超蛋白家族成员的程序性死亡受体-1(Programmed death receptor-1，PD-1)的单克隆抗体已被美国食品药品管理局(FDA)批准用于包括卵巢癌在内的实体肿瘤的治疗，取得了良好的效果[5]。本研究通过对卵巢上皮癌组织中B7H3、B7H4蛋白表达改变进行研究，旨在为该病的生物标志物发掘及免疫靶向治疗药物开发提供有价值的研究基础，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择本院妇产科2018年3月至2020年3月收治上皮性卵巢癌患者106例作为研究对象，纳入研究组。纳入标准：①均经病理检查诊断明确为上皮性卵巢癌，符合《卵巢癌诊疗规范(2018年版)》[6]；②同意接受病理检查；③临床资料完整。排除标准：①合并其它恶性肿瘤者；②合并慢性感染性疾病者；③入院前接受过放化疗、靶向治疗者；④治疗中途转院者。选择同期医院收治的卵巢良性患者50例作为对照组，收集其卵巢组织，研究组年龄32～75岁，平均年龄(53.18±5.24)岁，绝经前34例，绝经后72例，对照组年龄33～71岁，平均(52.29±4.94)岁，绝经前29例，绝经后43例，两组患者年龄、绝经状态比较差异无统计学意义。本研究纳入对象均签署对研究的知情同意书并经医院医学伦理委员会审核通过。

1.2 卵巢癌组织B7H3、B7H4检测

将本院病理科收集的组织蜡块只做为组织切片，经DAB免疫染色、恒温烘烤、二甲苯脱蜡及梯度乙醇脱水等步骤后，加入一抗进行孵育，孵育完成后将倍比稀释的B7H3及B7H4抗体加入组织切片表面，4 ℃孵育过夜后，采用PBS洗涤，二抗再次孵育完成后加入DAB显色液进行脱水显色、封片，所用抗体购自北京中杉金桥公司。由两名病理科医师进行独立盲法结果判定：根据切片的阳性细胞比例及着色深度进行计分，以半定量法统计结果，视野下阳性细胞百分率判定：0分：>5%，1分：5%～25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：>75%。阳性细胞着色深度判定：0分：无色或与背景色重叠，1分：浅棕黄色，2分：棕黄色，3分：棕褐色，将细胞阳性百分率判定得分与着色深度判定得分相乘结果为免疫组化染色评分。

1.3 血清中可溶性B7H3、B7H4检测

患者在入院后抽取其外周静脉血2 ml，常规离心分离血清后，采用酶联免疫吸附法检测血清中可溶性B7H3、B7H4蛋白水平，试剂盒购自上海酶联生物有限公司，均按照试剂盒说明书中操作。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 不同卵巢癌患者病灶组织及血清中B7H3、B7H4蛋白表达水平比较

上皮性卵巢癌患者病灶组织、血清中B7H3、B7H4水平均高于卵巢良性肿瘤患者，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同卵巢癌患者病灶组织及血清中B7H3、B7H4蛋白表达水平比较

2.2 上皮性卵巢癌病灶组织中B7H3、B7H4蛋白表达水平与临床病理特征的相关性

上皮性卵巢癌患者病灶组织中B7H3、B7H4表达水平与FIGO分期、肿瘤大小、淋巴结转移有关，差异具有统计学意义(P<0.05)，与年龄、组织学类型、腹腔积液无关，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3 上皮性卵巢癌血清中B7H3、B7H4蛋白表达水平与临床病理特征的相关性

上皮性卵巢癌患者病灶血清中B7H3、B7H4表达水平与FIGO分期、肿瘤大小、淋巴结转移有关，差异具有统计学意义(P<0.05)，与年龄、组织学类型、腹腔积液无关，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

3 讨论

据研究统计我国每10万人中有5人患有卵巢癌，每年新发死亡病例超过15万例，对女性健康具有较大的危害性[7]。根据病理学分型，卵巢癌可分为上皮性卵巢癌和非上皮性卵巢癌两种，其中上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是卵巢癌最常见的病理类型，占比超过90%，其组织学类型又可进一步分为浆液性癌、黏液性癌、子宫内膜样癌及透明细胞癌型[1,8]。早期卵巢癌5年生存率较高，最高可达90%，由于卵巢癌在疾病初期症状缺乏特异性，待其侵犯至盆腔后，才会出现明显的症状，因此在发现疾病时多已处于晚期阶段，即便治疗技术不断发展，其5年生存率也没有明显的提高[9]。目前临床中可用于卵巢癌早期诊断的生物标志物相对较少，特异性不足，因此需发掘可靠的生物标志物为患者的早期诊治提供依据。

表2 上皮性卵巢癌病灶组织中B7H3、B7H4蛋白表达水平与临床病理特征的相关性

表3 上皮性卵巢癌血清中B7H3、B7H4蛋白表达水平与临床病理特征的相关性

以负性共刺激为代表的免疫疗法近年来在各种恶性肿瘤的临床治疗中受到广泛关注，在肿瘤组织中负性共刺激分子可通过抑制肿瘤特异性免疫应答而维持免疫耐受功能，最终逃脱T淋巴细胞的免疫杀伤作用[10-11]。B7家族蛋白中B7H3、B7H4蛋白主要发挥负性调控作用，其中B7H3可抑制T淋巴细胞活化而对下游辅助型T细胞1/辅助型T细胞2及辅助型T细胞17/调节型T细胞的功能产生影响，而B7H4蛋白可对T细胞的增殖产生负反馈调节作用，过表达B7H4蛋白可导致肿瘤相关因子逃逸而造成肿瘤的进展。B7H3、B7H4在乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌等疾病中的临床价值已有文献报道，但在卵巢癌中报道相对较少[12-13]。本研究首先通过免疫组化法检测了上皮性卵巢癌及良性卵巢癌组织中B7H3、B7H4的表达水平，结果显示，上皮性卵巢癌组织中B7H3、B7H4的表达水平水平明显增加，因此B7H3、B7H4可能参加了恶性卵巢癌的发生过程，与国外学者报道[14]一致。血清中表达的B7H3、B7H4是二蛋白的可溶性形式，为该蛋白全长序列的胞外段形式，吕鑫等[15]研究结果显示，可溶性B7H3在继发性嗜血细胞型淋巴组织增多症患者血清中表达增加，且与疾病进展及不良预后有关。陈欣然等[16]研究结果表明，可溶性B7H4浓度随食管癌癌前病变的程度增加而提高，对于食管癌癌前病变具有良好的判断价值。本研究结果显示，血清中B7H3、B7H4水平明显高于良性卵巢肿瘤患者，考虑到经济性的问题，检测血清中B7H3、B7H4水平对于判断良、恶性卵巢肿瘤具有一定价值。本研究进一步探讨了上皮性卵巢组织及血清中B7H3、B7H4蛋白水平与临床病理特征的相关性，结果表明，在卵巢组织及血清中，B7H3、B7H4蛋白均与FIGO分期、肿瘤大小、淋巴结转移有关，说明B7H3、B7H4在肿瘤免疫微环境中可能参与了上皮性卵巢癌的发生、发展进程，对于判断疾病分期及转移情况具有一定的意义。

动物研究发现，利用单克隆抗体技术阻断B7H3、B7H4的表达可有效抑制部分实体肿瘤的生长进程，因此B7H3、B7H4作为上皮性卵巢癌免疫靶向治疗的靶点也具有一定的潜力[17]。本研究结果受限于病例数较少，且随访年限较短，未对不同B7H3、B7H4蛋白表达水平上皮性卵巢癌患者预后做进一步的分析，本研究的结论及后续的机制研究有待更多体内、体外实验的进一步检验。