EGFR、ALK和ROS1基因突变与肺腺癌病理分型的相关性研究

李 杰 赵 健 陈启斌 朱 亮 马 杰

肺癌是肺部最常见的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占80%[1]。肺腺癌是NSCLC中所占比例最高的类型，好发于不抽烟者及女性[2]。由于肺腺癌的异质性及多样性等特点，对临床放化疗治疗效果产生了一定的影响[3]。近年来，在小细胞肺癌中如表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)，间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)及种受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)等分子也成为了研究的热点。因此本研究和分析了EGFR、ALK、ROS1基因突变与肺腺癌主要病理分型之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2015年1月到2018年5月，就诊于安徽省胸科医院存档的肺腺癌活检标本及手术切除标本共369例。临床病理资料完整，患者术前均未行化、放疗。标本均经10%中性福尔马林液固定、石蜡包埋、切片及HE染色，由病理医师复阅切片明确诊断病理分型。按2015年世界卫生组织(world health organization,WHO)肺腺癌分型标准对选取的病例进行主要分型确认(贴壁型、腺泡型、乳头型、微乳头型、实体型)，鉴于肺腺癌的高度异质性，以占比例最多者为主要分型进行归组。

1.2 主要试剂与方法

石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(北京天根生化公司)。EGFR基因突变检测试剂盒，ALK基因融合检测试剂盒，ROS1融合基因检测试剂盒的相关检测试剂盒均购于厦门艾德生物医药科技有限公司。EGFR、ALK、ROS1基因状态均采用扩增阻滞突变系统(Amplificationrefractory mutation system,ARMS)法检测。获取样本后，采用ARMS荧光PCR法对EGFR、ALK、ROS1进行基因检测，根据艾德生物试剂盒说明书进行操作。采用BIO-RAD CFX-96实时荧光定量PCR基因扩增仪。

1.3 统计学方法

统计学分析研究数据应用SPSS 19.0进行分析处理。组间率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 369例腺癌一般资料

在369例非腺癌标本中，男性138例，女性231例，女性多于男性(P<0.05)；≥60岁的患者199例，<60岁的患者170例，无显著性差异(P>0.05)；216例有吸烟史，153例无吸烟史，有吸烟史例数显著多于无吸烟史(P<0.05)；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期195例，Ⅲ+Ⅳ期174例(P>0.05)。

2.2 369例肺腺癌EGFR、ALK及ROS1突变情况与病理特征的关系

369例肺腺癌病例中，分别检测到113例EGFR，82例ALK和30例ROS1基因的突变检测(表2)。其中女性EGFR、ALK基因的突变率高于男性(P<0.05)，无吸烟史患者EGFR、ALK基因的突变率远高于有吸烟史患者(P<0.05)。EGFR突变和ROS1突变与年龄无关(P>0.05)，而女性ALK基因突变高于男性(P<0.05)。ROS1突变与性别、吸烟史无显著差异(P>0.05)，见表1。

表1 EGFR、ALK及ROS1基因突变与临床特征的关系(例，%)

2.3 EGFR，ALK及ROS1突变的病理分型

EGFR突变病例检出腺泡型47例，贴壁型29例，乳头型15例，微乳头型5例，实体型17例；ALK融合病例检出腺泡型16例，贴壁型2例，实体型23例，乳头和微乳头型未检出；ROS1融合病例检出腺泡型18例，贴壁型1例，乳头型3例，实体型8例，微乳头型未检出。见表2。

表2 EGFR、ALK及ROS1突变的病理分型(例，%)

3 讨论

肺癌是目前癌症死亡相关的首要原因，其中最为常见的是非小细胞肺癌，占肺癌总数的80%～85%[4]。而在非小细胞肺癌中，最为常见的是类型是腺癌，其次为鳞癌[5]。以往非小细胞肺癌的治疗方式为手术切除，但是随着分子信号通路研究不断深入，靶向抑制肿瘤融合蛋白可以抑制肿瘤的生长，因此基于分子差异的靶向治疗逐渐成为非小细胞肺癌的治疗新方式[6]。

本研究共收集到369例肺腺癌标本，其中女性例数高于男性，无吸烟史例数高于有吸烟史；而年龄与TNM分期之间并无明显差异。结果显示肺腺癌在女性中好发，且吸烟与不吸烟患者患肺腺癌情况无显著差异，该结果也与以往的研究结果一致[7]。目前，肺癌标准治疗方法包括手术切除，放化疗等，而近年来特异性靶向治疗也逐渐成为重要的治疗方式之一。目前肺腺癌相关分子以EGFR、ALK、ROS1为主要研究。EGFR是1种其有酪氨酸激酶活性的糖蛋白，也是肺腺癌最常见的基因突变，主要由细胞内域、细胞外域和跨膜区三部分组成。当EGFR基因发生突变、过度表达或信号转导通路异常，便会导致DNA细胞分裂、复制过度，进而导致细胞生长失控、恶化，形成恶性肿瘤[8]。我们研究结果发现，EGFR基因突变与性别，吸烟情况存在显著相关关系，而与年龄无显著相关，且EGFR突变后的病理分析主要为腺泡型，其次为贴壁型。栾焕玲等的研究结果发现NSCLC患者EGFR基因突变率女性高于男性，肺腺癌高于肺鳞癌，无吸烟史患者数量高于有吸烟史[9]。Song等对161例手术切除的肺腺癌患者进行分析，结果发现EGFR突变则主要以微小乳头型为主[10]。还有研究人员进一步对EGFR突变的病例标本进行检测，EGFR不同位点的突变其病理类型也有不同，例如19外显子突变在乳头型中较高，其次为贴壁型；而21外显子突变为贴壁型中较高，其次为乳头型和实体型[11]。对于肺腺癌亚型与EGFR突变之间的关系在不同研究结果并不一致，但是能肯定的是EGFR的突变与病理类型之间仍存在一定联系。

ALK是1种跨膜酪氨酸激酶受体，正常仅表达于小肠，肇丸和脑组织，而不表达于正常肺组织[12]。当ALK其出现断裂时，可与其他基因相融合，异常激活下游的酪氨酸激酶，促进肺癌的发生发展[13]。2007年Soda等在NSCLC患者肿瘤标本中发现了棘皮动物微管相关蛋白-间变性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubuleassociated protein-like 4 gene and the anaplastic lymphoma kinase gene,EML4-ALK)融合基因酶，后来也有体外实验证实EML4-ALK具有高致瘤性[14]。已有的临床研究显示，ALK基因融合多发生于年轻，少吸烟的患者。而本次研究显示，ALK基因融合多发生于小于60岁，无吸烟史的患者，且女性数量高于男性，与已有结果类似，且本次结果中，ALK基因融合的病例类型以实体型为主。Yoshida等研究显示，ALK阳性的肺腺癌中分化差的实体型更为常见，而少见分化较好的腺泡型及贴壁型[15]。然而，Li等研究发现，ALK基因融合与性别和分期均无相关性[16]。因此，尽管在我们的研究中发现ALK基因融合与其病理类型有一定相关，但因其突变率较低，因此需要更多的研究以发掘其中关系。

ROS1是启动和促进肿瘤进程的关键分子，在信号转导中发挥着重要作用[17]。已有研究指出，ROS1基因融合的表达有阻碍生理功能及诱发病灶形成和致瘤的作用[18]。钟山等检测了302例患者，ROS1基因融合阳性率女性显著高于男性，非吸烟者高于吸烟者，但是无显著性差异。而本次研究结果显示，ROS1基因融合阳性率低于ALK融合和EGFR突变，ROS1基因融合阳性率与性别，年龄和吸烟史之间无相关关系，与已有研究结果一致。Go等检测了451例肺癌患者，结果也提示ROS1阳性率与性别，年龄和吸烟情况无显著相关性。此外，本次研究发现，肺腺癌中ROS1基因融合的病理类型以腺泡型为主，而高琪琪发现在非小细胞肺癌中，ROS1基因融合的主要病理类型为粘液型，且多见于腺癌[19]。

在本研究中通过收集369例肺腺癌患者标本，发现其中EGFR的突变率最高，其次为ALK基因融合和ROS1基因融合。不同类型的突变与性别，年龄和吸烟史之间相关性不同，且病理类型也不同。此外，也有研究指出，在肺腺癌中还可出现多个基因共同突变[20-21]，这也可能是出现多种不同病理类型的原因之一。而由于突变和类型位点不同，基因融合的类型不同，这与病理类型之间也存在着潜在的联系，其中潜在的机制需要进一步的探讨。