经典型霍奇金淋巴瘤组织中CSF-1R蛋白和FOXP3的表达及其与预后的相关性

王秋红 郑冬丽 司艳娟

经典型霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkinlymphoma，CHL)在霍奇金淋巴瘤中约占95%，以中青年人居多，好发于男性患者[1-2]。该病的形态学特征主要是特征性Hodgkin/Reed.Sternberg(HRS)细胞，细胞数量稀少，不到总细胞数的1%；还有大量的炎症细胞背景，包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、浆细胞、组织细胞、嗜酸细胞和中性粒细胞等构成肿瘤细胞生存的微环境[3-4]。近年来随着治疗的规范化，CHL治愈率逐步提高，目前有80%～90%的患者可被治愈，5年生存率可达70%～80%，但仍有5%～10%的患者会出现原发耐药，40%的患者出现缓解后复发，从而表现为复发难治[5-6]。因此，寻找新的生物指标来提示预后、指导治疗是有待解决的一大问题。有研究显示，HRS细胞周围的微环境在CHL的发生发展中起重要作用，并且与CHL的预后密切相关[7-9]。有文献报道，微环境中肿瘤相关的巨噬细胞(tumor associated macrophages，TAM)及细胞毒T细胞(cytotoxic T cells，CTL)相关的标志物与CHL的预后密切相关[9-11]。本研究旨在研究叉头转录因子3(forkhead box protein 3，FOXP3)、集落刺激因子1受体(colony stimulating factor 1 receptor，CSF-1R)在CHL中的表达，并结合患者临床特征和随访资料进行相关分析，探讨其评估CHL预后的价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2015年2月至2017年8月我院收治的45例CHL患者，其中男性27例，女性18例，中位年龄24岁(7～72岁)。所有患者均经手术或针吸穿刺活检获得病理组织，经病理及免疫组化确诊为CHL，其诊断标准参照2008版世界卫生组织(WHO)淋巴造血系统肿瘤分类标准。研究方案经我院伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2 标本处理及免疫组织化学检测

所有标本均经4%中性甲醛缓冲液固定，常规脱水、透明，石蜡包埋，制作3～4 mm切片。将组织标本置于65 ℃烤箱放置90 min，二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化，pH 7.4柠檬酸盐缓冲液高压修复3 min，冷却至室温，3%H2O2，浸泡20 min以去除过氧化物酶活性。CSF-1R抗体(Abcam，英国)，FOXP3抗体(Abcam，英国)4 ℃孵育过夜；室温孵育30 min，辣根过氧化物酶标记的通用二抗37 ℃孵箱孵育20 min；DAB显色，苏木精复染。实验均设阳性对照及阴性空白对照：阳性对照为已证实FOXP3及CSF-1R阳性的相应组织(扁桃体组织以及皮肤鳞状细胞癌)；阴性对照为以磷酸缓冲盐溶液(PBS)代替一抗工作液。每张切片选取5个高倍视野(×400)，计数阳性细胞数所占百分比，CSF-1R以阳性细胞数所占百分比<30%记为阴性(-)，≥30%记为阳性(+)；FOXP3以阳性细胞数所占百分比<25%记为低表达，>25%记为高表达。

1.3 EB病毒(EBV)编码的小mRNA(EBER)检测

严格按照EBER原位杂交试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)说明书进行操作。

1.4 治疗

45例患者中21例(46.7%)接受单纯化疗，24例(53.3%)接受放、化疗联合的综合治疗；其中40例(88.9%)患者接受以ABVD(阿霉素、博来霉素、长春花碱、达卡巴嗪)为主方案化疗，5例(11.1%)高肿瘤负荷的年轻患者以BEACOPP方案(博来霉素、依托泊苷、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼、泼尼松)化疗。患者化疗疗程数为4～8个周期(中位疗程数为6个周期)。放疗方式包括：扩大野放疗(extended-field radiation therapy，EFRT)和受累野放疗(involved-field radiationtherapy，IFRT)，18例患者接受EFRT，6例患者接受IFRT。中位放疗剂量36 Gy(20～50 Gy)。4例患者序贯行自体干细胞移植(autologous stem cell transplant，ASCT)。

1.5 随访

随访时间指从确诊为CHL至死亡或随访截止的时间，随访截止时间为2020年9月30日，45例患者均采用电话随访。总生存(OS)时间从疾病确诊计算至任何原因引起的死亡、失访或随访结束。无进展生存(PFS)时间定义为从初诊时间至第一次进展、复发或任何原因引起死亡的时间。

1.6 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计数资料比较采用χ2检验；以Kaplan Meier及Log-rank检验进行生存时间相关分析，寿命表法计算生存率；对Cox回归模型进行多因素分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHL患者临床病理特征

45例CHL患者中男性27例，6例患者年龄≥45岁。依据WHO 2008版淋巴瘤分类标准进行分类：23例(51.1%)为结节硬化型(NSHL)，19例(42.2%)为混合细胞型(MCHL)，2例(4.4%)为淋巴细胞消减型(LDHL)，1例(2.2%)为富于淋巴细胞型(LRCHL)。AnnArbor分期Ⅰ～Ⅱ期者27例(60.0%)，Ⅲ～Ⅳ期者18例(40.0%)。国际预后指数(IPI)评分1～2分者42例(93.3%)，3～5分者3例(6.7%)。根据B症状(发热、盗汗、6个月内体重减轻>10%)诊断标准，有B症状的患者共11例(24.4%)。血清乳酸脱氢酶(LDH)超过正常值高限(240 U/l)者15例(33.3%)，血清B2微球蛋白(B2-MG)超过正常值高限(2.60 mg/l)者5例(11.1%)。全部患者标本均进行了EBER原位杂交检测，检测结果显示EBV阳性率为37.8%(17/45)。

2.2 FOXP3、CSF-1R表达及其与临床特征的相关性

FOXP3高表达者23例(51.1%)；CSF-1R阳性者18例(40.0%)。将患者的临床特征分别与FOXP3、CSF-1R表达进行相关性分析，结果仅显示FOXP3表达与EBER相关(P=0.033)(表1)。

表1 CHL患者FOXP3、CSF-1R表达与临床特征的相关性分析(例，%)

2.3 疗效评价及预后分析

全组45例CHL患者中，截止到随访结束有18例患者死亡(40.0%)，18例患者均死于疾病复发进展。有27例(60.0%)患者存活。患者中位生存时间为69个月(14～119个月)，5年PFS率为55.6%(25/45)，5年OS率为77.8%(35/45)。对45例CHL患者的年龄、性别、分期等因素进行5年生存分析。结果显示，IPI评分(P=0.022)、FOXP3蛋白(P<0.001)及EBER(P=0.001)是影响患者5年PFS预后独立影响因素，见表2。

表2 CHL患者5年总生存和无进展生存的多因素分析

3 讨论

3.1 CHL患者FOXP3、CSF-1R表达及与常见临床特征的相关性分析

患者的FOXP3、CSF-1R蛋白表达与患者年龄、Ann-Arbor分期、有无B症状、LDH、组织学亚型等临床病理特征的相关性仍存在争议。Koh等分析112例CHL患者临床资料发现，CSF-1R蛋白表达仅与患者年龄(≥45岁)相关[12-15]。另外，他们还发现微环境中非肿瘤细胞CSF-1R蛋白高表达者，无事件生存(event.free survival，EFS)、OS均较差，并且CSF-1R蛋白的表达与CD163的表达密切相关，这与CSF-1蛋白诱导TAM向M2亚型极化、促进肿瘤进展有关[16-17]。CSF-1/CSF-1R信号通路在多种肿瘤中起促瘤作用。在卵巢癌中，CSF-1与其受体CSF-1R共表达，是预后不良的标志，并且可以作为肿瘤分级的诊断指标。

3.2 CHL患者5年无进展生存和总生存单因素以及多因素分析

本研究发现微环境中CSF-1R蛋白的表达与CHL患者的5年OS密切相关。目前CSF-1R抑制剂PLX3397在CHL群组中进行二期临床试验，且显示出一定的治疗疗效。另外一种CSF-1R的抑制剂JNJ_40346527，在复发难治的CHL中也显示良好的耐受性。关于FOXP3蛋白表达与CHL患者EBV感染之间的相关性，Baumforth等研究发现FOXP3蛋白的表达与EBV感染相关，与本研究结果一致[18-19]。EBV感染CHL患者后，通过编码EBV核抗原1(EBVnuclear antigen 1，EBNAl)蛋白诱导趋化因子CCL20表达上调。CCL20表达的上调，促使微环境肿瘤细胞周围调节性T细胞(Treg细胞)数量增多，进而促使EBV感染的肿瘤细胞(HRS细胞)发生病毒特异性免疫反应逃逸。在卵巢癌、非小细胞肺癌等实体瘤的研究中发现，FOXP3蛋白高表达提示患者预后不良。与实体瘤相反，Krausz等发现在霍奇金淋巴瘤(HL)中肿瘤浸润的Treg数目与患者的预后呈正相关，其原因可能与HL炎性微环境有关。在滤泡性淋巴瘤的研究中也得出一致结论[20-22]。Greaves等认为在CHL中FOXP3蛋白高表达者OS较好，且FOXP3蛋白的表达与CD68蛋白的表达相关[23-25]。本研究发现，FOXP3蛋白的表达与患者的5年PFS密切相关，是影响该组CHL患者5年PFS的独立预后因素。另外，本研究发现EBV感染是影响该组CHL患者5年PFS、OS的独立预后因素，但样本量偏少，难以避免统计结果的偏倚，准确结论有待进一步增加病例数及开展多中心研究予以证实。

综上所述，微环境相关的预后因子FOXP3、CSF-1R均与CHL患者的预后相关，对CHL患者的预后起一定判断作用，同时也为CHL的靶向治疗提供了新的线索及理论依据。