杧果细菌性角斑病菌对杧果酚类代谢的影响

李国平，郑 磊，柳 凤

(中国热带农业科学院南亚热带作物研究所/海南省热带园艺产品采后生理与保鲜重点实验室/农业部热带果树生物学重点实验室，广东湛江，524091)

杧果细菌性角斑病又名杧果细菌性黑斑病、杧果细菌性溃疡病，是由柑桔黄单胞菌杧果致病变种Xanthomonascitripv.mangiferaeindicae(Xcm)引起的杧果生产上的主要病害。该病可为害杧果叶、茎、花和果实等大部分组织，如遇到高温高湿或者台风雨天气，病害发生尤为严重。该病的最大特点是果实染病后，果面布满斑点，失去商品价值，严重时可造成落果失收，且该病一旦发生即使利用化学农药控制住其进一步蔓延，但染病果实面上的斑点却无法去除，果实商品价值大打折扣，因此预防该病发生对杧果生产十分重要[1]。

次生代谢在寄主植物抵御微生物侵染过程中发挥着至关重要的作用，酚类物质是植物抗病反应的主要次生代谢生化物质。植物体内酚类物质的代谢是一个复杂过程，主要通过苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶等酶类催化苯丙烷代谢途径合成木质素、类黄酮、植保素、醌类等物质[2-3]，这些物质参与植物自身细胞引起过敏性反应、氧化还原反应、木质化形成和对毒素的应激活性等生理过程[4-5]。研究表明，酚类物质的升高降低与植物抗性无明显相关性，各种物质之间通过相关转化从而协调作用[6-7]。本研究以细菌性角斑病高抗品种“红杧6号”和高感品种“贵妃”杧为试材，通过比较人工接种病原菌后感病和抗病品种果实内酚类代谢的差异，旨在阐明Xcm侵染对杧果酚类代谢的影响，丰富杧果细菌性角斑病病理的基础理论，为进一步研究病害发生的内在机制以及杧果细菌性角斑病的防控提供有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试病原菌编号Xcm003，由本实验室分离自杧果细菌性角斑病典型症状的杧果果实，致病性测定具有强致病力，经形态学观察、生理生化测定及全基因组测序鉴定为柑桔黄单胞菌杧果致病变种Xanthomonascitripv.mangiferaeindicae[8]。根据田间表型和室内离体接种病菌观察的结果，选择细菌性角斑病高抗品种“红杧6号”和高感品种“贵妃”杧为供试杧果品种进行试验。

1.2 试验设计

试验在本单位农业部隔离检验检疫室内进行，选取健康生长的“红杧6号”和“贵妃”杧1年生实生苗，每个品种5株，以摇床培养48 h后浓度约为4×106cfu/mL的Xcm003悬浮液作为接种体，采用刺伤接种法接种嫩叶(黄转绿)，接种无菌水为对照，接种后保湿培养，分别在接种后12、24、48、96、144、192 h取样，每次取样随机选取叶片5片，重复测定3次。

多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性测定参照李荣花等方法加以改进[9]。总酚、类黄酮相对含量测定参照Pirie等的方法，总酚相对含量用OD280/g·FW表示，类黄酮相对含量用OD325/g·FW表示[10]。阿魏酸相对含量参考邱永祥的方法并略有改进[11]，木质素相对含量参照翟艳霞的方法[12]测定。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2007 软件和SPSS 10.0 for Windows软件统计分析数据，采用Duncan’s(邓肯氏)进行多重差异比较，p<0.05为差异具有显著性。

2 结果与分析

2.1 多酚氧化酶活性变化

接种病菌后，杧果抗感品种叶片内多酚氧化酶活性变化见图1。无论是抗病品种还是感病品种，接种病菌后多酚氧化酶活性均明显高于其对照(无菌水)处理。感病品种“贵妃”杧接种48 h就达到顶峰，是其对照(无菌水)的1.8倍，随后一直保持较高水平。“红杧6号”接种病菌96 h前多酚氧化酶活性变化不明显，与其对照(无菌水)无显著性差异，但接种144 h后活性上升3～4倍，接种144 h“红杧6号” 多酚氧化酶活性比其对照(无菌水)高2.6倍。综合来看，感病品种应激反应较快，但是上升幅度低于抗病品种。

图1 两个杧果品种接种杧果细菌性角斑病菌后叶片多酚氧化酶活性变化

2.2 苯丙氨酸解氨酶活性变化

杧果抗感品种接种病菌后，叶片内苯丙氨酸解氨酶活性变化见图2。“红杧6号” “贵妃”杧叶片苯丙氨酸解氨酶活性均有所提高，在接种病菌48 h和144 h时达到各自峰值，分别为4 371 U/(g·min)和8 837.5 U/(g·min)，是其对照的2.0和6.3倍。综合比较发现，接种病菌后抗感病品种苯丙氨酸解氨酶活性变化速度基本一致，但感病品种“贵妃”杧苯丙氨酸解氨酶活性升高的幅度较大。

图2 两个杧果品种接种杧果细菌性角斑病菌后叶片苯丙氨酸解氨酶活性变化

2.3 总酚相对含量的变化

从图3中可以看出，接种病菌后杧果抗感病品种叶片内总酚相对含量较各自对照(无菌水)发生明显变化，“红杧6号”总酚相对含量呈现先上升后下降的趋势，但是总体水平明显高于其对照(无菌水)处理。感病品种“贵妃”杧接种病菌后前期(96 h前)与其对照(无菌水)无明显差异，总酚相对含量呈下降趋势。综合分析可以初步推断，总酚相对含量与杧果抗性呈正相关。

图3 两个杧果品种接种杧果细菌性角斑病菌后叶片总酚相对含量变化

2.4 类黄酮相对含量的变化

类黄酮因其具有杀菌和抑菌作用，因而在植物抗病反应中被广泛关注。由表1可以看出，抗感品种对照(无菌水)处理的叶片类黄酮相对含量始终保持在一个稳定状态，其中感病品种类黄酮相对含量高于抗病品种，取样时段的平均值分别为99.46 OD325/g和76.78 OD325/g。接种病菌后，类黄酮在抗感品种中均发生明显变化。抗病品种“红杧6号”叶片中类黄酮相对含量迅速上升，12 h增幅41.33%，24～96 h期间增幅79%以上，144～192 h趋于稳定，但仍明显高于清水处理。感病品种“贵妃”杧的类黄酮相对含量增幅不明显，且后期显著低于其对照(无菌水)。综合分析可以推测，类黄酮相对含量变化与杧果抗性可能呈正相关。

表1 两个杧果品种接种杧果细菌性角斑病菌后叶片类黄酮相对含量的变化

2.5 阿魏酸相对含量的变化

由表2可以看出，病菌侵染对杧果叶片中阿魏酸相对含量有明显的影响，在抗病品种 “红杧6号”中，阿魏酸相对含量呈现先增加后下降的趋势，24 h增幅最大，为34.78%。感病品种“贵妃”杧阿魏酸相对含量与其对照(无菌水)相比，随着时间的延长不断的减少。抗病品种“红杧6号”和感病品种“贵妃杧”对照(无菌水)的比较，阿魏酸相对含量较稳定，且差异不显著。由此推断阿魏酸相对含量与杧果的抗性可能呈正相关。

表2 两个杧果品种接种杧果细菌性角斑病菌后叶片阿魏酸相对含量变化

2.6 木质素相对含量的变化

木质素作为植物细胞壁的主要成分，在植物抵御病菌侵染过程中起重要作用。由表3可以看出，抗病品种“红杧6号”接种病菌后木质素相对含量有所提高，增幅最大值出现在接种病菌144 h，比对照增幅17.93%。感病品种“贵妃”杧在接种病菌后木质素相对含量变化缓慢，增长幅度约5%左右。综合比较发现，病菌侵染后，抗病品种木质素相对含量提高幅度高于感病品种，可能通过增加细胞壁的厚度来抵御病菌侵入，从而达到抗病效果。

表3 两个杧果品种接种杧果细菌性角斑病菌后叶片木质素相对含量变化

3 结论与讨论

酚类化合物是植物体本身的固有成分，是植物体次生代谢产物中最重要的化合物之一，参与植物色素合成、生长发育、信号转导、抗氧化机理和逆境防御等生化过程中。酚类化合物包括苯丙烷类、黄酮类、倍酸型、鞣花酸型、羟基芪类和单宁类等[3，13]。酚类化合物在植物抵御不良环境、病原物侵染的过程中起到重要的抗逆作用已引起广泛关注，其主要通过合成抗性物质、抑制或杀死病原细胞和刺激寄主细胞产生抗性反应等方式来提高寄主的抗病能力[14]。咖啡受咖啡炭疽病菌侵染后，抗性品种在早期产生黄酮类、羟基肉桂酸衍生物等酚类物质，促使咖啡发生过敏性反应形成坏死斑和加速细胞壁的木质化增加细胞厚度，从而进一步阻碍病菌的蔓延[15]。唐永萍等以秦冠、富士、金冠苹果果实为材料，通过损伤接种灰葡萄孢菌后发现，抗病苹果品种通过调节果肉内酚类物质代谢，增强次生代谢能力，其中类黄酮和木质素含量的增加强化了果实的抗性反应，进而提高对灰霉病的抗性，但总酚含量与植物抗病性关系不大[16]。张云霞等为探寻甘蓝抗黑腐病的生理生化机制，以抗病材料C7和感病材料C26为试验材料，在甘蓝幼苗期，喷施病菌悬浮液发现，抗病品种和感病品种苯丙氨酸解氨酶活性均先显著增加后迅速下降，但抗病品种的酚类物质和木质素含量后期无明显变化[17]。

本研究以杧果细菌性角斑病不同抗性杧果品种为材料，研究了接种病菌后杧果叶片内总酚、类黄酮、木质素相对含量及酚类代谢相关酶(苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶)活性的变化趋势。结果表明，接种病菌后，感病品种“贵妃”杧和抗病品种“红杧6号”内总酚、类黄酮、阿魏酸、木质素相对含量，苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活性均直线上升，其中总酚、类黄酮、阿魏酸、木质素相对含量增幅在抗病品种中高于感病品种，且感病品种接种后期总酚和类黄酮相对含量均迅速降低；感病品种的苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶活性增幅较高。病菌侵染对杧果酚类代谢产生显著影响，推测杧果叶片的总酚、类黄酮、阿魏酸、木质素相对含量与杧果抗性呈正相关，而苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶活性与抗病性呈负相关。由于植物抗病性是一个多体系混合作用的复杂机制，酚类物质代谢途径与其他抗病机制如何协调互作有待进一步研究。