基于网络药理学探讨人参-钩藤药对治疗原发性高血压的作用机制

郭经奇，李 莹，任雯庆，薛振宇，范吉林，张世亮

原发性高血压是我国最常见的慢性病、多发病，患病率占所有高血压病人的90%，发病率占世界人口的27%，原发性高血压长期控制不佳会导致诸多并发症，如动脉粥样硬化、心脑血管疾病、肾脏疾病等[1]，如今该病知晓率、治疗率、控制率逐年增高，但因基数庞大，仍需进一步提高。目前临床上主要通过西药控制血压，长期服用降压西药会导致越来越多的不良反应，病人依从性降低，由于大众对中药认知度的增高，中医中药的应用就显得尤为重要。人参-钩藤是张世亮教授临床治疗原发性高血压的常用药对，长期的临床观察发现该药对的应用不但有明显的降压疗效，而且对心、脑、肾等器官的保护也有效果。现代药理研究发现人参中的人参皂苷Rb1有降压作用，人参皂苷Rb1有明显的抗氧化作用，其降压作用可能与部分抗氧化应激相关[2]。研究发现钩藤碱有降压和保护心肌的作用，其机制可能与阻断肾素-血管紧张素-醛固酮(RUSS)系统，保护血管内皮细胞，促进一氧化氮(NO)合成和调节血浆与局部心肌组织中叶素(IMD)的水平有关[3-4]。目前研究更多关注单个药物和单种成分的作用，人参-钩藤药对治疗原发性高血压的作用机制尚不明确，其系统性研究少有报道。本研究基于网络药理学，系统分析该药对的有效活性成分和作用靶点，利用数据库分析核心蛋白，主要功能和主要途径分析通过基因本体(GO)功能富集分析和基于京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，为指导临床和今后的深入研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 药物潜在有效成分的获取 登录中药系统药理学数据库(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/)，分别以人参和钩藤为关键词进行检索，获得人参和钩藤所有的化学成分，包括化学成分的名字(moleclue name)、生物利用度(OB)、类药性(DL)等。众所周知，药物不是所有的化学成分都能发挥治疗作用，OB包括生物利用程度和生物利用速度，程度是指中药经口服进入机体吸收入血后，经过肝脏首过效应进入血液循环的药量百分比，速度则指药物进入血液循环达到有效剂量的时间。OB是决定药物的化学成分是否具备有效活性的关键指标。DL是指化学成分与已知药物的相似度，可体现此化学成分成为药物的可能性。结合文献研究，将OB>30%、DL>0.18作为条件，筛选出人参和钩藤的潜在有效成分。

1.2 药物潜在靶基因的获取 继续通过TCMSP数据库检索人参和钩藤所有成分的靶点，并与已得到的潜在成分相映射，获得潜在靶点，利用Uniprot数据库(http：//www.uniprot.org/)将人参和钩藤有效靶点与人类相关基因相对应，获得药物的潜在靶基因。

1.3 原发性高血压靶基因的获取 登录GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)，以essential hypertension为关键词进行检索，获得原发性高血压的所有相关靶基因，并导出到Excel，为后续处理做准备。

1.4 药物-疾病-靶点韦恩图的绘制 为了观察人参-钩藤药对与原发性高血压的关联，利用Rx64 3.6.2软件，将已获得的药物潜在靶点和疾病靶基因导入，从而获得该药对治疗疾病的有效靶点的基因名，并绘制出韦恩图。通过韦恩图可以更加直观地看出人参-钩藤药对是通过多基因、多靶点来治疗原发性高血压。

1.5 药物-疾病-活性成分-靶点网络的构建 将药物疾病的共同靶点与药物的潜在活性成分相映射，获得有效活性成分，将共同靶点与药物的有效活性成分导入Cytoscape 3.7.2软件，获得药物-疾病-活性成分-靶点网络图。

1.6 核心靶标蛋白互作(PPI)网络图的构建 为了进一步获取关键靶点，利用STRING数据库(https://string-db.org/)，将药对和疾病的共同靶点导入该数据库，并限定物种为人类物种(homo sapiens)，获得PPI网络图，检索研究相关文献，为确保可信度，将交互分数限定为>0.4，去除无相互作用的单一蛋白，获得最终的PPI网络图，导出图片并以TSV格式保存结果，利用Rx64 3.6.2软件，挑选出前30名核心靶标，并绘制柱状图。

1.7 GO分析与KEGG通路分析 为了分析人参-钩藤药对作用于原发性高血压的生物功能过程和通路传导过程，从而更清晰地阐述作用机制，利用ClusterProfiler对筛选出的药物和疾病的共同靶点基因进行GO分析和KEGG分析。

2 结 果

2.1 潜在有效成分筛选结果 通过TCMSP数据库收集到人参195个化学成分、钩藤65个化学成分，共260个化学成分。以OB>30%、DL>0.18作为条件，筛选得到潜在的有效成分，其中，人参22个潜在成分，钩藤32个潜在成分，共获得54个潜在有效成分，如豆甾醇、β-谷甾醇、人参皂苷Rh2、人参皂苷Rh4、钩藤碱、花生四烯酸等。详见表1。

表1 人参-钩藤药对潜在有效成分

2.2 药物-疾病靶基因结果与韦恩图的绘制 在获得的人参-钩藤54个潜在有效成分中，通过Uniprot数据库共找到人类相关靶点191个，通过GeneCards数据库共找到原发性高血压靶点5 614个，利用Rx64 3.6.2软件取两者交集，得到药物与疾病的共同靶点176个，并绘制韦恩图。详见图1。

2.3 药物-疾病-活性成分-靶点网络构建 通过映射共获得人参-钩藤治疗原发性高血压的有效成分46个，将有效成分与共同靶点导入Cytoscape 3.7.2软件获得可视化的调控网络图，见图2。图中共有224个节点、934条边，节点包括药物、疾病、活性成分、靶点，而边则表示他们之间存在相互关系，红色菱形代表疾病，蓝色六边形代表药物，紫色三角形代表活性成分，绿色圆形代表靶点基因，通过此网络直观地看出人参-钩藤药对治疗原发性高血压是通过多种成分、多种靶点来发挥作用。

图1 药物-疾病靶点韦恩图

图2 药物-疾病-活性成分-靶点网络图

2.4 PPI网络图与核心靶标柱状图 利用STRING数据库获得PPI网络图(见图3)，图中共有176个节点、2 938条边，节点代表蛋白，浅蓝色边代表来自管理的数据库(from curated databases)，紫色边代表实验测定(experimentally determined)，绿色边代表基因相邻(gene neighborhood)，红色边代表基因融合(gene fusions)，深蓝色边代表基因共现(gene co-occurrence)，黄色边代表文本挖掘(textmining)，黑色边代表共表达(co-expression)，淡蓝色边代表蛋白质同源性(protein homology)。利用R软件挑选出前30位核心靶标并绘制柱状图(见图4)，如RAC-α丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、白细胞介素-6(IL-6)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、凋亡信号分子3(CASP3)、JUN蛋白、丝裂原激活蛋白激酶8(MAPK8)、表皮细胞生长因子(EGF)等，提示这些靶标可能为人参-钩藤治疗原发性高血压的关键核心成分。

图3 蛋白互作网络图

图4 核心靶标柱状图

2.5 GO分析与KEGG通路分析 利用ClusterProfiler将筛选出的疾病和药物共同靶点进行GO分析，为了数据更准确，设置P-value cut off为0.05，q-value cut off为0.05，共得到了165条GO生物功能，选取前20位主要功能绘制柱状图和气泡图。详见图5、图6。参与的功能主要有核受体活性(nuclear receptor activity)、转录因子活性(transcription factor activity)、肾上腺素能受体活性(adrenergic receptor activity)、类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity)、G蛋白偶联胺受体活性(G protein-coupled amine receptor activity)的调节及儿茶酚胺结合(catecholamine binding)、铵离子结合(ammonium ion binding)、细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)等。继续进行KEGG通路富集分析，共获得156条通路，选取前20条绘制柱状图和气泡图。详见图7、图8。参与的通路包括信号通路，如糖尿病并发症中的糖基化终末产物-糖基化终末产物受体信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、白细胞介素-17(IL-17)信号通路、缺氧诱导因子1(HIF-1)信号通路等，疾病通路如流体剪应力与动脉粥样硬化通路(fluid shear stress and atherosclerosis)、前列腺癌通路(prostate cancer)、膀胱癌通路(bladder cancer)等，结果显示，人参-钩藤药对治疗原发性高血压与多种生物功能、多种通路密切相关。

图5 前20位生物功能柱状图

图6 前20位生物功能气泡图

图7 前20位通路柱状图

图8 前20位通路气泡图

3 讨 论

原发性高血压属于中医学“眩晕”范畴，早在《内经》中提到“上虚则眩”，上虚者，上气不足也，宜治其气。人参则能补气醒脑益智。《内经》病机十九条中提到“诸风掉眩，皆属于肝”，眩晕为风证，属肝之病变。钩藤归肝经，又能息风止痉平肝。人参、钩藤二药合用，具有补气平肝之功效。

本研究基于现代药理研究与网络药理学平台探讨人参-钩藤药对治疗原发性高血压的作用机制，共收集到46种有效成分。如豆甾醇(stigmasterol)属于植物甾醇，具有抗氧化、抗炎、降低胆固醇、抗糖尿病的作用[5]。研究表明山奈酚(kaempferol)可显著抑制核因子-κB(NF-κB)通路来发挥抗炎症作用[6]。人参皂苷Rh2可通过抑制IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎性因子以及抑制NF-κB通路和MAPK信号通路发挥抗炎作用，通过诱导细胞分化和凋亡，抑制多种肿瘤细胞的增殖以抗肿瘤，通过提高血清血管内皮生长因子(VEGF)等来改善心肌缺血[7-8]。黄华等[9]研究发现，钩藤碱(Rhynchophylline)通过影响转化生长因子β1(TGFβ1)及Smad通路降低血浆中血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)，从而改善大鼠心肌重构和调节血压。总之，人参-钩藤药对可能通过抗炎症、抗氧化以及抑制AngⅡ等多种过程治疗原发性高血压。

药物-疾病-活性成分-靶点网络图的构建，可直观感受到人参-钩藤药对治疗原发性高血压是通过多成分、多靶点发挥作用。PPI网络图显示各蛋白靶点之间关系密切，相互作用最多的前3位蛋白靶点为AKT1、IL-6、VEGFA。苗艳菊等[10]利用AngⅡ诱导小鼠造成高血压心肌纤维化，通过荧光定量聚合酶链反应(PCR)法和蛋白免疫印迹(Western Blot)法分别检测AKT1 mRNA与蛋白的表达，发现AKT1的表达与活化参与高血压心肌纤维化的发展。炎症过程中IL-6的低甲基化与高血压密切相关，而血清中VEGFA含量过高时会影响血管内皮功能，炎症和内皮功能障碍在原发性高血压中起重要作用[11-12]。因此，PPI网络也体现出作用机制是复杂多样的。

GO分析和KEGG分析结果显示，人参-钩藤治疗原发性高血压主要涉及肾上腺素受体信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路等。肾上腺素受体是一种G蛋白偶联受体，与儿茶酚胺的结合会刺激交感神经系统，肾脏交感传出系统的过度激活可影响肾脏血流动力学，从而影响肾素-血管紧张素-醛固酮(RAAS)系统引起血压的变化，因此，抑制肾交感神经的过度亢奋可有效防治高血压[13]，人参、钩藤可能通过调节肾上腺素受体活性，抑制受体与儿茶酚胺的结合，抑制RAAS系统来控制血压。有研究表明，MAPK信号通路与血管紧张素1型受体(AT1)和AngⅡ的结合有关，通过催化脂酰甘油(DAG)的生成激活蛋白激酶C(PKC)，进一步激活MAPK信号通路，直接或者间接抑制MAPK信号通路的激活不仅可以有效降低血压，而且可以逆转高血压造成的心肌肥厚[14-15]。TNF是一种炎性因子，可与其肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)相结合，TNFR1的刺激能引起NF-κB及MAPK的激活，原发性高血压或AngⅡ引起的高血压均与炎症反应密切相关，介导炎症反应的NF-κB信号通路在降压过程中发挥重要作用[16]。结合已有文献，分析结果显示人参-钩藤药对可能通过肾上腺受体信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路等治疗原发性高血压。

综上所述，本研究初步揭示了人参-钩藤药对通过多种靶点、多种成分、多种功能与信号通路协同发挥治疗原发性高血压的作用，除已报道的文献，仍有部分研究结果需要进一步实验证实，共同探讨药物的作用机制，为临床提供理论依据。