人源pEGFP-C1-p38γ真核表达质粒的构建及其功能研究
2021-02-07 01:55:54潘林鑫李良云杨俊发
安徽医科大学学报
2021年1期
胡 爽，杨 莉，陈 晨，潘林鑫，李良云，杨俊发，周 焕，徐 涛
细胞外信号调节激酶P38γ是P38 MAPKs的一个亚型，P38γ与人类约一半的癌症、感染、自身免疫性疾病等引起的炎症有关，其主要是通过对炎症信号通路调节，从而促进肿瘤的发生。相关实验表明p38γ可能是肝癌治疗的一个新靶点，p38γ可能在肝脏疾病的发生发展中起到关键性的作用。相关研究表明p38γ在非酒精性肝病中高表达，且沉默p38γ后能够减轻小鼠脂肪变性的程度。然而，p38γ在酒精性肝病中的表达情况及其对炎症因子的调节作用尚不清楚。L0-2细胞是正常人源肝细胞，常用于研究酒精性肝病中炎症分泌及脂质代谢的相关调节机制。故选取 L0-2细胞，用100 mmol／L乙醇刺激细胞24 h，研究p38γ对相应炎症因子的调节作用。该实验将通过构建p38γ的过表达质粒，研究p38γ对乙醇刺激后的L0-2细胞的增殖和凋亡及其炎症因子白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表达情况的影响。
1 材料与方法
1.1 试剂与材料
L0-2细胞株（安徽医科大学药学院保存）；Annexin V-FITC／PI双染细胞凋亡检测试剂盒（上海BestBio公司）；p38γ抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；Western blot试剂盒、超敏ECL化学发光试剂及TRIzol Reagent RNA提取试剂（上海Beyotime公司）；细胞培养瓶及培养板（无锡NEST公司）；PVDF膜（上海安谱实验科技股份有限公司）；DMEM培养基、胎牛血清（北京沃卡威生物技术有限公司公司）。1.2 方法
1.2.1 重建质粒的构建 pEGFP-C1-p38γ人源质粒由安徽通用生物系统有限公司构建，并送至上海生工生物有限公司测序鉴定。
1.2.2 pEGFP-C1-p38γ质粒的转染及实验分组L0-2细胞置于6孔板中培养至60%。将A液（200 μl的Opti-MEM及1μg pEGFP-C1-p38γ质粒）与B液（200μl的Opti-MEM及4μl Lipofectamine2000脂质体……
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