Wnt6过表达改善PINK1突变转基因帕金森病果蝇的生物学行为①

范晓丽，夏穗瑞，孙 莉

(桂林医学院药学院，广西 桂林 541199)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见的神经退行性疾病，主要特征表示为行动迟缓、静息性震颤等运动障碍和非运动障碍[1-2]。PD的发生受遗传、环境等因素影响，发病机制复杂，其中线粒体功能障碍在PD发生中具有重要作用[3]。研究表明，线粒体功能相关基因Parkin和PINK1的突变与家族性PD有关[4]。PINK1突变可导致线粒体功能受损，从而引起相关的神经毒性，进而引起细胞凋亡[5]。Wnt信号通路能调节细胞周期、生长和增殖[6]，并参与调控神经元的凋亡[7]。Wnt6是经典的Wnt信号传导分子，研究表明Wnt6参与胚胎早期发育和器官形成[8]，但其对帕金森病的作用尚不清楚。笔者探讨Wnt6对帕金森病果蝇的生物学作用。

1 材料与方法

1.1 材料

果蝇品系W1118野生型、UAS-Wnt6 OE均购自美国Bloomington果蝇中心；果蝇品系UAS-PINK1B9/FM7-MHC-GAL4为中南大学医学遗传学国家重点实验室馈赠。

1.2 果蝇构建

构建MHC-GAL4/UAS系统的转基因果蝇。正常对照组： 将MHC-GAL4 处女蝇与W1118 雄蝇杂交，收取 F1 代，基因为(W1118/+； MHC-GAL4/+)的目标果蝇。PINK1B9疾病组： 将(UAS-PINK1B9/FM7； MHC-GAL4)的处女蝇与 W1118 雄蝇杂交， 收取 F1代，基因型为(UAS-PINK1B9/y； MHC-GAL4/+)。Wnt6 过表达(Wnt6 overexpression，Wnt6 OE)干预组： 将(UAS-PINK1B9/ FM7； MHC-GAL4)的处女蝇与UAS-Wnt6 OE 果蝇的雄蝇杂交，收取 F1 代，基因型为(UAS-PINK1B9/y； MHC-GAL4/Wnt6 OE)。

1.3 Real-Time PCR检测mRNA表达

每组30只转基因目标雄果蝇，第5天取其胸部组织，分别提取总mRNA，逆转录得cDNA，再以cDNA为模板，使用 7500 Fast Real-Time PCR System( Applied Biosystems) 仪器进行PCR反应，检测基因mRNA表达水平，引物序列如下：18S上游5’-TCTAGC AAT ATG AGA TTG AGC AAT AAG-3’，下游5’-AAT ACA CGT TGA TAC TTT CAT TGT AGC-3’；PINK1上游5’-GTG CCT TCA ATG TGA CTT CT-3’，下游5’-TGC TCT GGA TGT CGT AGT T-3’；Wnt6上游5’-TGC GTT TGC TCA TGG TAA TTG-3’，下游5’-TTG GAT CGA GAA GGA TGT TGG-3’，引物由上海生工生物工程有限公司设计合成。

1.4 果蝇形态学观察

随机挑选第5天的雄蝇，每组100只，置于挑蝇板上，CO2麻醉后，每5只装入1个透明的玻璃管中，视为一个观察单位，待果蝇1 h后完全苏醒。……