MDM2环状RNA在急性髓系白血病患者骨髓中的表达及临床意义

赵倩，吴德龙，苏肖宇，朱昕，楚明强，林江，邓兆群

(1. 江苏大学附属人民医院中心实验室，江苏 镇江 212002； 2. 镇江市精确诊断与治疗重点实验室，江苏 镇江 212002)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一种血液系统恶性肿瘤，以髓系造血祖细胞的异常增殖、分化和成熟障碍为特征[1]，是成人最常见的白血病[2]。尽管强化化疗和同种异体干细胞移植取得了进展，由于难治性、复发、治疗耐药性与治疗相关的死亡率等原因，大多数AML患者的预后仍然较差，其5年生存率仅约为24%[3]。分子生物学的研究有助于揭示AML的发病机制，遗传缺陷被认为是影响化疗反应和患者预后的最重要因素[4]。因此，探寻潜在的分子标志物非常重要，可为优化AML患者治疗方案提供指导与依据。

环状RNA(circular RNA, circRNA)是反向剪切形成的一类非编码RNA，无5′-3′极性和多聚腺嘌呤尾巴，近年来已被证明在癌症生物学中具有关键的调节作用[5]，例如充当微小RNA(microRNA)海绵或与RNA相关蛋白结合以形成调节基因转录的RNA-蛋白质复合物以及编码调节肽[6-7]。鼠双微粒体2(murine double minute 2，MDM2)是一种重要的致癌基因，是抑癌基因p53的负调节因子，MDM2-P53相互作用的一些抑制剂已作为治疗各种血液病和实体肿瘤的药物进行了临床试验，MDM2具有降解p53及泛素化的功能，参与肿瘤的发生、发展，并与胚胎发育和组织分化相关[8-10]。MDM2环状RNA(circ-MDM2)是由MDM2第4-8个外显子环化而成，其对AML生物学功能的影响尚不清楚。

本研究检测了AML患者骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells，BMMNCs)中circ-MDM2的表达水平，并分析circ-MDM2表达与临床参数的关系，为AML的分子诊断及潜在的靶向治疗提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 临床标本

本研究中的骨髓标本均采自江苏大学附属人民医院，包含92例初发的AML患者及22例对照组。患者的详细临床资料如性别、年龄、白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、骨髓原始细胞比例、缓解率、核型和基因突变情况来自病历。全体参与者签署了知情同意书，本研究经江苏大学附属人民医院伦理审查委员会批准。所有患者的诊断及临床分型标准符合法美英合作组(French-American-British Cooperative Group，FAB)和2016版世界卫生组织(World Health Organization，WHO)分型标准[11-12]。

1.2 主要材料

淋巴细胞分离液(天津TBD Sciences公司)；红细胞裂解液(上海碧云天公司)；RNA提取试剂盒Trizol为美国Life Technologies Corporation公司产品；逆转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒购于日本TaKaRa公司。

1.3 实验方法

1.3.1 circ-MDM2引物设计及合成 根据Circbase中基因序列，运用circPrimer1.2软件设计实时定量PCR(qPCR)引物，引物由上海华大基因科技有限公司合成，引物序列如下，circ-MDM2上游：5′-GCCATCGAATCCGGTTCTTTT-3′，下游：5′-CTTGGCAC-GCCAAACAAATC-3′ ；ABL上游：5′-TCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGA-3′，下游：5′-TCCAACGAGCGGC-TTCAC-3′。

1.3.2 BMMNCs分离、总RNA提取及逆转录合成cDNA 向已取得的骨髓标本中先后加入淋巴细胞分离液与红细胞裂解液各5 mL，分别2 000 r/min离心5 min，弃上清液后获得BMMNCs。按Trizol说明书采用苯酚-氯仿抽提法，提取BMMNCs中的总RNA。依据逆转录试剂盒说明书利用随机引物将每个样品中2 μg的总RNA经逆转录PCR合成cDNA。反应条件：预变性(65 ℃ 5 min)1个循环；PCR反应(30 ℃ 10 min，45 ℃ 45 min，95 ℃ 5 min)40个循环。

1.3.3 qPCR检测circ-MDM2的表达水平 本实验通过qPCR检测circ-MDM2及内参基因ABL的表达。circ-MDM2表达水平的计算公式为：Ncirc-MDM2=(Ecirc-MDM2)△CT circ-MDM2(对照-实验)÷(EABL)△CT ABL(对照-实验)。每次实验均含有阳性质控(目的基因质粒)和阴性质控(水)。PCR扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳，电压100 V，跑胶结束后在RED凝胶成像仪下成像，观察引物的特异性及确定最适退火温度。

依据qPCR试剂盒说明书，qPCR反应系统总体积为20 μL，由2 μL cDNA、0.8 μL circ-MDM2或ABL上游、0.8 μL circ-MDM2或ABL下游、10 μL SYBR Premix TB Green、0.4 μL ROX参比染料Ⅱ及6 μL灭菌蒸馏水组成。

circ-MDM2、ABL反应条件：预变性(95 ℃ 30 s)1个循环；扩增(95 ℃ 5 s变性，61 ℃ 32 s退火，72 ℃ 30 s延伸，80 ℃ 30 s收集荧光)40个循环；解链程序(95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s)1个循环。

1.4 统计学分析

数据处理、统计学分析应用SPSS 20.0 软件和GraphPad Prism 7.0进行。χ2检验、Yates校正公式或Fisher确切概率法用于两组分类变量的比较。Mann-WhitneyU检验用于两组连续性变量的比较。受试者工作特征(ROC)曲线评价circ-MDM2表达水平对AML的诊断意义。以P<0.05(双侧)为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AML患者BMMNCs中circ-MDM2的表达

circ-MDM2的表达水平以中位数(范围)表示，对照组为0.146 8(0.000 0～1.000 0)，全体AML患者为0.144 6(0.000 0～3.074 0)，非急性早幼粒细胞白血病[AML without acute promyelocytic leukemia，AML(非APL )]患者为0.140 3(0.002 2～2.306 0)，正常核型AML(cytogenetically normal AML，CN-AML)患者为0.147 2(0.000 0～2.306 0)。与对照组相比，circ-MDM2表达水平在AML、AML(非APL )、正常核型AML患者中均明显升高(图1)。

图1 circ-MDM2在对照组及AML患者中的相对表达量

2.2 circ-MDM2表达对AML的诊断效能

ROC曲线评价结果表明，曲线下面积为0.649，95%可信区间为0.523～0.776(图2)。ROC曲线的截断值为0.191，灵敏度为0.467，特异度为0.864。上述结果提示circ-MDM2表达水平可作为区分AML患者与对照组的潜在标志物，具有辅助诊断意义。

图2 ROC曲线分析circ-MDM2表达用于鉴别AML和对照组

2.3 circ-MDM2表达水平与AML患者临床参数的关系

根据ROC曲线的截断值0.191，将AML患者分为高表达组(≥0.191)和低表达组(<0.191)，分别比较高、低表达组之间各临床参数的差异，结果见表1。circ-MDM2低表达组CEBPA的突变率明显高于circ-MDM2高表达组(P=0.039)；circ-MDM2高、低表达组在性别、年龄、白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、骨髓原始细胞比例、缓解率、染色体分型、核型及其他8个基因突变方面均无统计学差异。

2.4 circ-MDM2表达水平与AML患者预后的关系

为了阐明circ-MDM2表达水平与AML患者预后的关系，将具有随访资料的60例AML患者纳入研究。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，circ-MDM2高、低表达组AML患者的总体生存时间和无白血病生存时间的差异均无统计学意义(P>0.05，图3)。

表1 circ-MDM2表达与AML患者临床参数间的关系

续表1

图3 circ-MDM2表达对AML患者总体生存时间及无白血病生存时间的影响

3 讨论

作为一种新型的RNA，circRNAs具有独特的环状结构，该结构源自反向剪接过程产生[13]。由于其高稳定性、组织特异性表达模式以及在各种体液中的广泛分布，circRNAs具有作为人类疾病生物标志物的巨大潜力[14]。研究表明circRNAs在AML中存在异常表达且对AML进展有影响，如circ_0004277在新诊断未经治疗的和复发的AML患者中表达均降低[15]；circ-VIM过表达是一个独立的不良预后因素，并且与AML患者的总体生存期缩短显著相关[16]。

MDM2已成为癌症治疗中的热门话题，Sciot[10]已探索到阻断MDM2-P53相互作用的分子，并因此重新建立野生型p53活性，这一结果使抗MDM2治疗成为现实。Chaudhary等[17]分析了未经处理或未使用DNA损伤剂处理的结直肠癌细胞系(HCT116，RKO和SW48)的RNA-seq数据，结果发现circ-MDM2是少数源自p53诱导基因的circRNAs之一，circ-MDM2可以通过抑制p53水平来控制细胞周期进程。为了探讨circ-MDM2对AML生物学功能的影响，本研究收集AML患者及对照组骨髓样本，检测circ-MDM2的表达水平，结果发现circ-MDM2在AML患者中表达升高，circ-MDM2的表达水平可作为区分AML患者与对照组的潜在生物标志物。

近年来研究发现除了细胞遗传学异常外，一些基因突变在AML中对预后分层有重要价值，如正常核型AML中性梳样蛋白1(additional sex combs like-1，ASXL1)[18]，TET癌基因家族成员2(tet oncogene family member 2 ，TET2)[19]，肾母细胞瘤1(Wilms′ tumor 1，WT1)[20]等基因突变常提示预后不良，核磷素1(nucleophosmin1，NPM1)[21]，CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT enhancer binding protein α，CEBPA)[22]等基因突变常提示预后良好。CEBPA在AML患者中经常发生突变，在新发AML患者中发生双等位突变率平均5%，亚洲患者的发生率更高(平均12%)，并且双等位基因CEBPA突变被认为是一个新型预后标志物[23]。CEBPA是一种关键的髓系转录因子，它对造血干细胞自我更新和髓系分化过程中驱动转录程序都很重要[24-25]。本研究结果表明circ-MDM2低表达组患者CEBPA的突变率明显高于circ-MDM2高表达组患者。Kaplan-Meier生存曲线分析表明circ-MDM2低表达组AML患者的总体生存时间与无白血病生存时间较circ-MDM2高表达组有延长趋势，可能与circ-MDM2低表达组更易发生CEBPA突变有关。但circ-MDM2表达与CEBPA突变之间的作用机制尚不明确，需要进一步实验加以验证。

综上所述，本研究显示circ-MDM2表达上调是AML患者中常见的事件，骨髓circ-MDM2水平对AML具有一定的诊断价值，可作为区分AML患者与对照组的潜在生物标志物。circ-MDM2表达与CEBPA突变有关，与患者的总体生存时间和无白血病生存时间无明显关系。但本研究病例数较少，后续将扩大标本量，进一步探讨circ-MDM2在AML中的生物学功能。