构建MS2-RIP方法用于鉴定lncRNA DANCR 在肿瘤细胞中的相互作用分子

巫孟师，熊敏敏，彭 丹，韩 雪，钟小敏

（中山大学中山医学院干细胞与组织工程研究中心，广东广州 510080）

DANCR（differentiation antagonizing non-protein coding RNA）是一个最初在人表皮祖细胞中被发现具有维持细胞未分化状态功能的长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）分子［1］。近年来的研究显示，DANCR 在多种肿瘤中存在异常高表达的现象，提示其在肿瘤的发生和发展中具有重要作用［2-7］。虽然DANCR 在肿瘤发生发展中的重要功能逐渐被揭示，但是对于DANCR 作为癌基因（oncogene）的作用机制尚未完全探讨清楚。研究结果表明，lncRNA 发挥功能的主要方式之一是直接结合具有调控功能的蛋白质或核酸分子［8-11］。为了阐明DANCR 在肿瘤细胞中的作用机理，本研究致力于构建一种基于MS2 RNA 结合蛋白的特性，用于鉴定与DANCR 相互作用的生物活性分子的新方法。MS2 RNA 结合蛋白实质为RNA型噬菌体MS2 外表面的衣壳蛋白，通过特异性结合噬菌体复制酶编码基因5’端由19 个核苷酸组成的RNA 茎环结构，即MS2 结合位点（MS2 Bind⁃ing Site，MS2 BS），起着保护噬菌体核酸以及抑制翻译的作用［12］。本研究计划构建表达Flag-MS2-EGFP 融合蛋白以及串联表达DANCR-MS2 BS 的两种载体，使用Flag 抗体对MS2 RNA 结合蛋白进行免疫沉淀，同时对DANCR-MS2 BS 进行富集，并进一步使用已被证明为DANCR 相互作用分子的EZH2 蛋白作为阳性对照［11］，验证MS2-RIP 方法的效果。成功构建MS2-RIP 方法，对于探讨DANCR 的工作机理具有重要的推动作用，也可以为鉴定其他lncRNA 的相互作用分子提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株、菌株及质粒

人结肠癌HCT116 细胞（购自中国科学院细胞库）及大肠杆菌菌株DH5α（购于天根生化科技有限公司）。pPyCAGIP（由Prof.Austin Smith from University of Cambridge 赠予），pSL-MS2-12X 和pMS2-GFP质粒（购于Addgene公司）。……