淫羊藿甙干预脂肪间充质干细胞修复膝骨性关节炎的作用及相关机制研究

余永林 吴家顺 热合米丁·艾买提 周 倩 刘华慧 管晓舫

(武汉市中医医院二桥院区，武汉 430051)

骨性关节炎又称退行性关节炎、老年性关节炎等，是因关节软骨受到磨损或破坏引发的关节与关节周围病变，其病理改变以软骨退变为核心，伴随关节边缘骨质增生与关节周围软组织炎症反应。临床上主要通过非甾体类抗炎药物缓解骨性关节炎的症状，目前尚无直接治愈或能够完全修复重建软骨组织的药物，因此软骨损伤与退变后的修复重建一直是医学研究的难题。

间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)具有良好的旁分泌能力与免疫调节活性，可直接分化形成特异性结缔组织细胞并迁移至受损部位，刺激祖细胞增殖，抑制软骨细胞凋亡与软骨变性，进而促进组织修复，在骨性关节炎与软骨损伤治疗中具有重要意义[1-3]。脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cell,AMSC)与其他成体干细胞相比，具有来源丰富、增殖能力强、体积小、可传代次数多、干细胞特性稳定等诸多优势，在骨性关节炎与软骨损伤治疗中受到广泛关注，并取得了较好的效果[4-5]。

淫羊藿甙为淫羊藿的主要有效成分，具有补肾阳、壮筋骨等药理活性，可促进骨髓细胞DNA合成并激活成骨细胞信号通路，促进MSC的成骨分化，促进骨形成，同时还可以通过调节炎症与免疫等改善软骨微环境，已成为治疗骨性关节炎的常用中药[6-7]。体外研究显示，淫羊藿甙可促进MSC增殖并诱导其向软骨细胞分化[8]。本实验主要观察淫羊藿甙干预的AMSC治疗兔骨性关节炎的效果，并分析其可能的作用机制，以期为中药联合MSC移植治疗骨性关节炎的临床应用提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 健康成年雄性新西兰大白兔，清洁级，体重2.3～2.5 kg，单笼饲养，采用标准饲料喂养，饲养环境温度20℃～25℃，相对湿度50%～60%，自由进食水，正常光照。严格依照《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规定处理与饲养实验动物。

1.1.2实验应用的主要试剂 淫羊藿甙(489-32-7，纯度：98%)为麻城市进鑫生物科技有限公司产品；一氧化氮(NO)、IL-1、TNF-α ELISA检测试剂盒为上海仁捷生物科技有限公司产品；TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65一抗为艾博抗(上海)贸易有限公司产品；HRP标记的二抗为博士德生物工程有限公司产品；DMEM培养基为武汉纯度生物科技有限公司产品；胎牛血清为南京生航生物技术有限公司产品。

1.2方法

1.2.1提取与鉴定AMSC 以3 ml/kg的剂量腹腔静脉注射10%水合氯醛麻醉新西兰大白兔3只，分离获取其颈背部皮下的脂肪组织，去除血管等组织，PBS清洗3次后双抗浸泡10 min，PBS清洗3次，将脂肪组织剪碎至乳糜状后置于15 ml离心管，加入3倍体积的Ⅰ型胶原酶消化25 min，以含胎牛血清的培养基终止消化后过滤胶原酶消化液与脂肪颗粒，2 000 r/min 离心8 min，弃上清，加入含胎牛血清的DMEM培养基，8 h后首次换液，以后每3 d换液1次。约6 d时胰酶消化后第1次传代，以后每第4～5 d传代1次，直至得到第2代AMSCs。取第2代AMSCs悬液，调整细胞浓度为1×106个/ml，分装于EP管中，分别加入单抗(CD90-FITC、CD105-FITC、CD44-FITC、CD14-FITC、CD45-FITC、CD19-FITC)标记，流式细胞术检测AMSC免疫细胞表型。

1.2.2配制淫羊藿甙培养基 将2 mg淫羊藿甙溶解于2 ml DMSO，加入20 μl PBS，采用 0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，获得1 mg/L的淫羊藿甙溶液，置于4℃环境中备用。进行实验时，采用含10%胎牛血清的DMEM培养基将淫羊藿甙溶液配制成20、40、60 g/L的浓度使用。

1.2.3淫羊藿甙对AMSC增殖的影响 ①提取第2代AMSCs，胰酶消化后接种于96孔板，150 μl/孔(约含细胞5×106个)，观察细胞贴壁后分5组处理，A组更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基，B组更换为成软骨诱导培养基，C组更换为20 g/L的淫羊藿甙培养基，D组更换为40 g/L的淫羊藿甙培养基，E组更换为60 g/L的淫羊藿甙培养基，每组3复孔，培养48 h内，每孔加入MTT液15 μl，检测细胞增殖吸光度值。以此结果筛选细胞增殖良好的淫羊藿甙浓度；②提取第2代AMSCs，胰酶消化后接种于96孔板，150 μl/孔(约含细胞5×106个)，观察细胞贴壁后分3组处理，F组更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基，G组更换为成软骨诱导培养基，H组更换为60 g/L的淫羊藿甙培养基，每组3复孔，培养3 d内每天取1块板进行MTT检测。以此筛选细胞增殖良好的处理时间。

1.2.4淫羊藿甙对AMSC软骨分化的影响 取F、G、H组细胞，每隔1 d换液一次，培养 21 d 后进行甲苯胺蓝染色，观察软骨基质生成情况。

1.2.5建立骨关节炎动物模型 采用10%水合氯醛麻醉30只新西兰大白兔，将其仰卧位固定，在右后肢关节间隙切3 cm的纵行切口，打开关节腔后切断内侧副韧带，打开关节囊后切断前交叉韧带并剔除内侧半月板，生理盐水冲洗后消毒，逐层缝合后包扎伤口。术后肌注抗生素预防感染。术后6周制作右膝关节软骨病理切片证实造模成功。造模成功后2周将实验兔随机分3组，实验组右侧膝关节腔内注射60 g/L淫羊藿甙溶液干预3 d的AMSCs悬液1 ml(约含细胞数1×107个)，对照组右侧膝关节腔内注射AMSCs悬液1 ml(约含细胞数1×107个)，空白组右侧膝关节腔内注射生理盐水1 ml。

1.2.6关节液炎症因子检测 干细胞注射14 d后麻醉大鼠，向右后肢膝关节内注射1 ml生理盐水，反复抽吸数次后抽取关节液，2 500 r/min离心12 min，将上清液置于-20℃环境中保存。ELISA法检测上清液内NO、IL-1与TNF-α浓度。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.7关节软骨病理切片分析 关节液抽吸完成后处死所有大鼠，分离获取膝关节软骨标本。将其置于100 g/L多聚甲醛中48 h，4℃脱钙4周，进行常规石蜡包埋与切片处理，切片厚度约4 μm，取部分切片进行常规苏木精-伊红染色，无水乙醇脱水后二甲苯透明，中性树胶封固后镜下观察。

1.2.8软骨损伤Mankin′s评分 由两名对实验不知情的病理科医师对膝关节软骨病理切片进行Mankin′s评分，最后计算平均分。该评分包括软骨结构、软骨细胞数量与潮线的完整与否3个方面，评分0～14分，评分高说明软骨破坏严重。

1.2.9软骨细胞凋亡检测 取部分膝关节软骨标本切片脱蜡，加入蛋白酶K工作液反应20 min，PBS清洗3次后添加TUNEL反应混合液反应60 min，PBS清洗4次后添加DAB显色液反应5 min，苏木精复染40 s，镜下观察细胞凋亡情况。每张切片随机选取6个视野记录凋亡细胞数与细胞总数，计算凋亡率。

1.2.10软骨组织内蛋白表达检测 取软骨组织50 μg，加入适量裂解液检测蛋白浓度，上样电泳，转膜，以含脱脂奶粉的封闭液浸泡PVDF膜2 h；将PVDF膜浸泡于稀释的一抗[TLR4(1∶1 000)、MyD88(1∶1 000)、TRAF6(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶500)、β-actin(1∶1 000)]孵育液内24 h；清洗PVDF膜5次，将其浸泡于HRP标记的二抗孵育液内2 h；清洗PVDF膜5次，ECL显色、曝光。

2 结果

2.1AMSC鉴定结果 流式细胞术检测显示，AMSC高表达CD90、CD105、CD44，低表达CD14、CD45、CD19，表现出了较高的细胞纯度，见图1。

图1 流式细胞术检测AMSCs免疫表型

2.2淫羊藿甙对AMSC增殖的影响 培养48 h后，A、C组细胞增殖吸光度值比较差异无统计学意义(P>0.05)，B、E组比较差异无统计学意义(P>0.05)，B、D、E组细胞增殖吸光度值高于A组(P<0.05)，B、E组细胞增殖吸光度值高于D组(P<0.05)，见图2A，结果显示60 g/L的淫羊藿甙培养基可明显促进AMSCs增殖。培养3 d内，F、G、H组细胞增殖吸光度值均随时间延长逐渐增加，培养1 d时3组间细胞增殖吸光度值比较差异无统计学意义(P>0.05)；培养2 d、3 d时的G、H组细胞增殖吸光度值高于F组，且G、H组细胞增殖吸光度值比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2B，结果显示60 g/L淫羊藿甙培养基培养3 d可明显促进AMSCs增殖。

图2 细胞增殖检测结果

2.3淫羊藿甙对AMSC软骨分化的影响 F组未见特征性甲苯胺蓝异染(图3A)，G、H组胞浆可见特征性的甲苯胺蓝异染(图3B、C)。

图3 AMSCs的甲苯胺蓝染色(×100)

2.4关节液炎症因子检测 空白组关节液内NO、IL-1与TNF-α浓度高于对照组和实验组(P<0.05)；对照组NO、IL-1与TNF-α浓度高于实验组(P<0.05)，见表1。

表1 各组炎症因子浓度比较

2.5关节软骨病理切片分析 空白组软骨表面粗糙不平整，软骨层较薄，软骨细胞排列紊乱，表层可见脱落的软骨细胞，深层可见软骨细胞减少或簇集排列，潮线模糊不清；对照组软骨表面较光滑且平整，关节软骨层次较完整，软骨细胞排列较空白组规则，软骨细胞数量较多，可见较清晰的潮线；实验组软骨表面光滑平整，各层细胞排列规则有序，软骨细胞数量多于对照组，可见清晰且完整的潮线，见图4。

图4 各组软骨切片病理观察(×100)

2.6软骨损伤Mankin′s评分 空白组、对照组、实验组软骨损伤Mankin′s 评分分别为9.24±1.27、6.17±1.47、4.36±0.78，空白组评分高于对照组、实验组(P<0.05)，对照组高于实验组(P<0.05)。

2.7软骨细胞凋亡检测 空白组凋亡软骨细胞最多，实验组凋亡的软骨细胞最少，见图5。空白组、对照组、实验组软骨细胞凋亡率分别为(30.28±6.13)%、(19.23±2.09)%、(12.66±1.17)%，空白组细胞凋亡率高于对照组、实验组(P<0.05)，对照组高于实验组(P<0.05)。

图5 各组软骨细胞凋亡观察(×200)

2.8软骨组织内蛋白表达检测 与空白组相比，对照组与实验组软骨组织内的TLR4、MyD88、TRAF6与NF-κB p65蛋白表达量均减少(P<0.05)；且实验组TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65蛋白表达量均低于对照组(P<0.05)，见图6。

图6 各组软骨组织内蛋白表达检测

3 讨论

MSC在干细胞生物学研究、细胞与基因治疗及组织工程研究中具有重要的应用价值，但是将其应用于临床还需要经体外扩增获得足够数量的MSCs。生长因子可促进MSCs增殖，但价格较高，且在临床应用中有诸多限制，因此近些年多数研究者开始利用中药或中药的有效成分促进AMSCs增殖。淫羊藿甙作为淫羊藿的有效成分价格低廉，可促进软骨细胞的增殖与软骨基质的分泌，抑制炎症反应，有效治疗骨关节炎。本实验结果显示，淫羊藿甙在体外呈浓度与时间依赖性促进MSCs增殖，验证了既往研究结论[9]。此外实验也证实，适当浓度的淫羊藿甙在体外可促进AMSCs分化为软骨细胞。由此科研组认为通过淫羊藿甙的诱导可调控AMSCs的增殖与向软骨细胞的分化。但是实验设计的淫羊藿甙浓度与作用时间有限，对于最佳的干预浓度与干预时间还有待进一步探讨。

骨性关节炎的病理改变非常复杂，其主要骨病理变化为关节软骨的变性与炎症因子的沉积等[10-11]。骨性关节炎患者关节腔内存在大量促炎症因子介导或促进关节软骨的破坏与关节周围骨赘的形成，进而促进骨性关节炎的形成或加重骨性关节炎，因此关节腔内炎症因子水平可反映骨性关节炎的严重程度[12]。本实验结果显示造模后兔关节腔内的NO、IL-1与TNF-α浓度明显升高，此3种炎症因子在关节腔内高水平聚集后作用于细胞，同时炎症因子间又相互协同作用，激活相关的信号转导通路，破坏关节软骨细胞与滑膜细胞的代谢，诱发关节软骨的降解、退变、老化及凋亡，加剧了关节炎症。应用淫羊藿甙溶液干预的AMSCs悬液治疗后，可显著降低骨性关节炎兔关节腔内的炎症因子水平，进而降低关节软骨的降解、退变与软骨细胞的凋亡，此结果在病理观察中得到证实。并且这种关节软骨的保护作用明显优于单独AMSC的应用。科研组认为淫羊藿甙溶液干预的AMSC可抑制关节腔内炎症因子水平，改善关节内微环境，降低关节软骨的降解并减少软骨细胞的凋亡，具有关节软骨保护作用。

本实验结果显示应用淫羊藿甙溶液干预的AMSCs悬液治疗可显著降低骨性关节炎兔关节软骨内的TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65蛋白表达。NF-κB p65是NF-κB转录因子在细胞中较常见的作用形式，与炎症因子产生、细胞增殖与凋亡、细胞外基质交联密切相关[13-14]。TLR4是Ⅰ型跨膜蛋白受体之一，其可通过下游的MyD88依赖性信号转导通路来激活各种炎症因子，研究证实其与骨性关节炎的发病与发展密切相关[15]。TLR4与MyD88缔合后将TRAF6募集到TLR4与MyD88的复合体，导致TRAF6的磷酸化，由磷酸化衔接子分子复合物将信号传播到下游MAP激酶-AP1和IKK复合物NF-κB，刺激炎症因子的释放。本实验结果说明，淫羊藿甙干预可能通过降低TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65蛋白的表达来减少关节腔内的NO、IL-1与TNF-α浓度，从而抑制炎症反应，进而降低关节软骨的降解并减少软骨细胞的凋亡。由此课题组认为淫羊藿甙发挥关节软骨的保护作用可能与调节TLR4/NF-κB信号通路有关。但是在淫羊藿甙发挥关节软骨的保护作用中是只通过TLR4/NF-κB信号通路还是有其他通路参与目前还不能得出确切的结论，下一步将进行TLR4/NF-κB信号通路阻断实验加以验证。

采用淫羊藿甙干预AMSCs可降低关节腔内NO、IL-1与TNF-α等炎症因子水平，改善骨性关节炎的微环境，抑制关节软骨细胞的凋亡，从而达到保护关节软骨的作用，且该作用可能与调节TLR4/NF-κB信号通路有关。本实验为中药联合MSCs治疗骨性关节炎提供了一定的实验数据。