聚(丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯)整体柱合成及其尿样中柚皮苷和橙皮苷固相微萃取应用

张珊珊，曹逸非，彭帆，余小芳，陈怀侠

(湖北大学化学化工学院，湖北 武汉 430062)

0 引言

柚皮苷(Naringin，NRG)和橙皮苷(Hesperidin，HPD)是一种广泛存在于柑橘类水果中的类黄酮物质，这类物质具有多种生物学活性和药理作用，如抗炎、抗病毒、抗癌、抗突变、抗过敏、抗溃疡、镇痛、降血压、降胆固醇、减少血栓的形成等.该类药物能够改善局部微循环和营养供给，可用于防治心脑血管疾病.在食品工业中可用作天然抗氧化剂，也可用于化妆品行业[1-3].

生物样品中NRG和HPD分析是该类药物药理研究基础.目前，生物样品中柚皮苷和橙皮苷分析方法主要有薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)[4]、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)[5-6]和气相色谱法(gas chromatography，GC)[7]以及联用技术等[8].

生物样品组成复杂，内源性物质、药物代谢产物等干扰成分多，目标物含量低，样品的前处理是其定量分析的关键步骤[9].固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)无需有机溶剂、萃取简便快速、操作简单、可进行现场分析[10-12].吸附剂的吸附性能是SPME研究的重点.有机聚合物整体柱制备方便，具有骨架和穿透孔双连续结构，传质阻力小，柱压低，生物兼容性好的特点，所以有机聚合物整体柱是SPME的理想吸附剂.已经有聚合物整体柱固相微萃取的研究报道[13-15]，但这些微柱合成于毛细管或塑料毛细管中，整体柱易断裂，使用寿命有限[16].目前，未见尿样中NRG和HPD聚合物整体柱微萃取的研究报道.

本研究通过合成条件的优化，在移液枪小枪头内制备聚(丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯，AA-EGDMA)整体柱，通过SPME条件的优化，将该微柱应用于尿样中NRG和HPD分离富集，建立了尿样中NRG和HPD的SPME-HPLC分离分析方法.结果显示，该方法操作简单、灵敏度和准确度高.

1 实验部分

1.1 试剂和材料柚皮苷(NRG，供含量测定用)和橙皮苷(HPD，供含量测定用)均购于中国药品生物制品鉴定所；色谱纯甲醇和乙腈(美国Fisher公司)；甲基丙烯酸(MAA，使用前减压蒸馏纯化)；丙烯酰胺(AM，使用前减压蒸馏)；(丙烯酸(AA，使用前减压蒸馏)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，美国Sigma公司，使用前用NaOH溶液萃取，再用超纯水洗后用无水MgSO4干燥)；偶氮二异丁腈(AIBN，上海试剂四厂，化学纯，使用前用无水乙醇重结晶)；分析纯甲苯、十二醇(使用前减压蒸馏)；水(超纯水).其他试剂均为分析纯，所有的溶液均在4 ℃下避光保存.

1.2 仪器及色谱条件Dionex ultimate 3000 HPLC配有二极管阵列检测器(PAD)(Dionex公司，美国)；Acclaim-C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm,美国Dionex公司)，配有材料相同的保护柱(2.1 mm×12.5 mm,5 μm，美国Agilent公司)；DZF-6021型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；兰格 LSP01-1A型注射泵(保定兰格恒流泵有限公司)；TGL 16 M型湘智离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)；移液枪枪头(4*49，200 μL)；WH-3微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂).

色谱流动相：甲醇∶水(40∶60,V/V)；流速为1.0 mL/min；柱温为25 ℃；20 μL定量环；检测波长为283 nm.

1.3 聚合物整体柱的制备聚合物整体柱通过热引发聚合的方法合成于移液枪头(4*49，200 μL)中.将AM(50 μL，50 mg)、EGDMA(420 μL，440 mg)、甲苯(130 μL)和十二醇(860 mg)和AIBN(4.5 mg)预聚混合液混匀并超声5 min.然后取50 μL预聚液灌入经甲醇清洗且一端密封的移液枪头中，用硅橡胶将另一端密闭，60 ℃反应24 h，得聚合物整体柱.用甲醇反复冲洗整体柱，除去制孔剂与未反应单体等杂质，备用.

1.4 固相微萃取过程整体柱固相微萃取步骤分为活化、萃取和解吸3个步骤，见图1.

图1 SPME过程

活化：用注射器吸取1.0 mL甲醇，用微量注射泵以1.0 mL/min 的流速推过萃取柱；再吸取0.2 mL的超纯水以相同的流速推过萃取柱.

萃取：吸取5.0 mL样品溶液以0.05 mL min-1的流速推过萃取柱.然后吸取0.2 mL的超纯水以同样的速度推过萃取柱，以清洗杂质.

解吸：吸取60 μL 80∶20的甲醇-水解析液以0.05 mL min-1的流速推过萃取柱，收集洗脱液，用于HPLC分析.

1.5 标准溶液和样品溶液的配制标准溶液的配制：分别配制1 mg/mL NRG和HPD的甲醇储备液，实验前分别用超纯水稀释，配制所需浓度的标准溶液以及NRG、HPD的混合标准溶液.

样品溶液的配制：取健康青年人尿样，加超纯水稀释10倍，用0.22 μm的滤膜过滤，避光保存于4 ℃，24 h内处理分析.

1.6 线性关系的考察取空白尿样分别添加10、15、50、500、2 000、5 000、10 000 ng/mL NRG和HPD，进行SPME-HPLC分析，获得峰面积和浓度之间的线性关系，同时进行重复性实验，每个浓度重复3次，计算相对标准偏差.

2 结果与讨论

2.1 萃取回收率的计算本实验以萃取回收率(ER)为评价指标，考察整体柱的吸附性能.其定义如下：

式中，Velu和Celu分别为洗脱液体积及其浓度，Vaq和Co分别为上样溶液的体积及其浓度.

2.2 合成条件的优化本实验按聚合物整体柱制备方法，制备不同功能单体和不同溶剂的整体柱，考察单体和溶剂对整体柱萃取性能的影响.结果见表1，可见聚(丙烯酰胺-乙二醇二甲基丙烯酸酯)整体柱柱压大，无法控制样品流速，难以实现SPME.聚(丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯)整体柱萃取效率要远高于聚(甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯)整体柱.而功能单体均为丙烯酸时，甲苯/十二醇混合溶剂要比甲苯/乙腈混合溶剂制备的整体柱对两种分析物的分离富集效果好.故后续实验选择以甲苯/十二醇混合溶剂制备的聚(丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯)整体柱.

表1 整体柱合成条件的优化

2.3 聚合物整体柱的表征以扫描电镜表征聚合物整体柱的物理形貌，见图2.可见，聚合物整体柱内部是微球颗粒的连续聚合体，有微米级的大孔(通孔)结构以及小孔，即该整体柱具有典型的骨架和孔道双连续性.

图2 聚(丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯)整体柱扫描电镜图

2.4 SPME条件的优化本实验以50 ng/mL NRG和HPD的混合溶液考察了SPME的洗脱液种类、样品溶液流速、体积、pH值及离子强度对ER的影响.

2.4.1 洗脱液种类和配比的选择 按照SPME步骤，考察甲醇-水和乙腈-水体积比分别为20∶80、40∶60、60∶40、80∶20、100∶0的洗脱效果.结果见图3(A)和(B).由图可见，总体来说，甲醇-水比乙腈-水洗脱效果好.80∶20甲醇-水和纯甲醇的洗脱效果相当，但纯甲醇洗脱液色谱峰对称性较差.所以后续实验选择80∶20的甲醇-水混合液进行洗脱.

2.4.2 样品流速的选择 分别用0.05～0.4 mL/min的流速进行SPME的上样,考察样品流速对萃取效率的影响，结果见图3(C).可见，样品流速增加，萃取效果降低，但样品流速太慢时，分离时间增加，故后续实验样品的流速为0.05 mL/min.

2.4.3 样品体积的选择 以1、2、3、4、5 mL NRG、HPD混合样品溶液进行萃取，考察样品体积对萃取效率的影响.由图3(D)可见，样品溶液体积的增加时，HPD回收率变化不大，NRG回收率逐渐增加.综合考虑实验速度和回收率，后续实验选择5 mL样品溶液进行分析.

2.4.4 样品溶液酸度的选择 酸度是影响萃取效率的重要因素.用磷酸调节样品溶液的酸度，在pH 2～7范围内考察样品pH值对萃取效果的影响.结果见图3(E).显然，随着样品溶液酸度的增加，萃取效果变差.这主要是因为随着酸度的增加，NRG和HPD稳定性下降，因此本实验选择不改变样品溶液pH值.

2.4.5 离子强度的选择 向样品溶液中分别加入0%、1%、2%、3%、4%、5%(质量百分浓度)固体NaCl，考察盐度对萃取效率的影响.由图3(F)可见，增加NaCl的加入量，萃取回收率下降，同时，柱压也逐渐变大.故后续实验的样品中不添加NaCl.

图3 甲醇-水解析液的配比(A)，乙腈-水解析液的配比(B)，样品流速(C)，样品体积(D)，样品溶液酸度(E)和样品溶液离子强度(F)对ER的影响

2.5 方法的考察和样品分析

2.5.1 方法的考察 按工作曲线制作方法，配制空白尿样加标不同浓度NRG和HPD的溶液，进行SPME-HPLC分离分析，获得线性方程.分别以信噪比等于3和10获得方法的检测限(LOD)和定量限(LOQ)，实验结果见表2.

表2 线性范围和检测限、定量限

在空白尿样中分别添加高、中、低浓度的NRG和HPD，计算方法的加标回收率，见表3.可见，该方法对NRG和HPD的加标回收率分别为83.5%～110.1%和82.6%～106.1%.日内RSD小于6.7%，日间RSD小于7.8%.

表3 方法的加标回收率(n=3)

由表4可见，和其他方法进行比较，本方法线性范围宽，检测限低.

表4 本方法与其他相关研究的比较

2.5.2 尿样分析 将该SPME-HPLC方法应用于健康人尿样中NRG和HPD的检测分析，实验结果表明，未检出分析物.在优化的SPME条件下，对添加NRG和HPD标准品的空白尿样进行SPME- HPLC分析，结果见图4.可见，该方法对NRG和HPD具有较好的分离富集效果，样品基质不干扰分析.

图4 空白尿样加标50 ng·mL-1 NRG和HPD SPME前(1)和后(2)的SPME-HPLC图

3 结论

本研究合成了聚(丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯，AA-EDGMA)整体柱，成功用于SPME-HPLC检测尿样中NRG和HPD.该方法线性好，精密度高，检出限低，为尿样中类黄酮类化合物的分离和检测提供了有效方法.